【摘要】：研究背景和目的： 突觸是神經(jīng)元間的特化結(jié)構(gòu)，由突觸前膜，突觸間隙和突觸后膜組成，是維持神經(jīng)元相互聯(lián)系的基本單元。正確的突觸形成是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，并受多種因素調(diào)節(jié)，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子，整合素及星型膠質(zhì)細(xì)胞等。BDNF (brainderived neurotropic factor,腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子)作為神經(jīng)因子家族重要成員之一，調(diào)節(jié)和維持神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能，如促進(jìn)突觸形成。 GIT1(G protein coupled receptor kinase interacting protein-1, G蛋白偶聯(lián)受體激酶相關(guān)作用蛋白-1)是由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的穿梭蛋白，通過影響細(xì)胞骨架，調(diào)節(jié)受體內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞的粘附和遷移及突觸的發(fā)育和維持等。GTI1可分別通過整合素，ephrin及scribble等通路調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸的發(fā)育。CaMKII (calcium/calmodulin-dependent protein kinase,鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶)是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過自己激酶活性或結(jié)構(gòu)特點(diǎn)調(diào)節(jié)突觸的形成和功能成熟。 本研究在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，，通過點(diǎn)突變，基因轉(zhuǎn)染及免疫共沉淀等技術(shù)，研究GIT1與CaMKIIβ是否參與BDNF誘導(dǎo)的突觸形成以及其中的分子機(jī)制。 方法： 1.分離，培養(yǎng)及鑒定大鼠原代皮層神經(jīng)元。 2. KN-93和GIT1-siRNA分別作用于神經(jīng)元，檢測(cè)對(duì)突觸形成的影響。 3.構(gòu)建HA-GIT1-WT(wild type，野生型), HA-GIT1(第419絲氨酸突變?yōu)楸彼�，S419A)和Flag-CaMKIIβ質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和原代皮層神經(jīng)元。 4.免疫印跡，免疫熒光及免疫共沉淀檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)和相互作用情況。 結(jié)果： 1.對(duì)培養(yǎng)至第6天的神經(jīng)元，分別使用神經(jīng)元特異性抗體β-tubulin III和NeuN進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示兩個(gè)抗體染色均呈陽性。 2.與對(duì)照組相比，BDNF顯著促進(jìn)突觸形成和p-CaMKIIthr286水平（P0.05）；KN-93和GIT1-siRNA能夠明顯抑制突觸形成（P0.05）；GIT1-siRNA明顯抑制CaMKII的磷酸化水平（P0.05）。 3.與GIT1-WT相比，在HEK293T細(xì)胞中，GIT1(S419A)與CaMKIIβ結(jié)合明顯下降（P0.05）；在皮層神經(jīng)元中，GIT1(S419A)與CaMKIIβ在神經(jīng)元突起處共定位明顯下降（P0.05）。 4.與GIT1-WT相比，GIT1(S419A)明顯抑制神經(jīng)元突觸形成。 結(jié)論： 1.在BDNF通路中，GIT1與CaMKIIβ參與皮層神經(jīng)元突觸的形成。 2.在BDNF通路中，GIT1(S419A)影響GIT1與CaMKIIβ的結(jié)合及CaMKIIβ激活； 研究背景與目的： BDNF不僅參與神經(jīng)元突觸的形成，還影響突觸形成后的功能。神經(jīng)遞質(zhì)釋放作為突觸重要功能之一，是神經(jīng)元之間聯(lián)系的物質(zhì)基礎(chǔ)。谷氨酸作為一種常見的神經(jīng)遞質(zhì)，其釋放也受BDNF的調(diào)控，但具體機(jī)制尚不明確。最近的研究表明BDNF與Src在調(diào)節(jié)神經(jīng)功能上存在相互關(guān)系。Src作為非受體酪氨酸激酶家族成員之一，通過作用于目的蛋白，參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)，但是目前，Src對(duì)谷氨酸釋的調(diào)控作用仍存在爭(zhēng)議。PLCγ1是PLC絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員之一，當(dāng)其酪氨酸783位點(diǎn)磷酸化后被激活，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。Src和PLCγ1之間存在相互關(guān)系，如通過GIT1，Src參與PLCγ1的調(diào)節(jié)。但是在BDNF通路中，兩者的關(guān)系還不確定。本研究通過體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，研究BDNF誘導(dǎo)下谷氨酸釋放的信號(hào)通路，以及BDNF, Src和PLCγ1之間的關(guān)系。 方法： 1.分離和培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元。 2. Trkb, Src, PLCγ1, Akt和Erk1/2的特異性抑制劑K252a, PP2, U73122,LY294002和PD98059處理皮層神經(jīng)元，檢測(cè)BDNF刺激條件下的皮層神經(jīng)元谷氨酸釋放。 3.免疫印跡和免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)Trkb, Src, PLCγ1, Akt和Erk1/2的相互關(guān)系。 結(jié)果： 1. BDNF顯著增加谷氨酸釋放，同時(shí)明顯增強(qiáng)Trkb，Src，PLCγ1，Akt，和Erk1/2的磷酸化水平（P 0.05）。 2. K252a在抑制BDNF刺激條件下Trkb磷酸化和谷氨酸釋放的同時(shí)，明顯抑制Src，PLCγ1，Erk1/2和Akt的磷酸化水平（P 0.05）。 3. PP2降低BDNF刺激皮層神經(jīng)元的谷氨酸釋放（P0.05），抑制Trkb和PLC-γ1磷酸化水平（P0.05），但對(duì)Erk1/2和Akt的磷酸化水平卻沒有影響（P0.05）。 4. U73122抑制BDNF刺激皮層神經(jīng)元的谷氨酸釋放（P0.05），但對(duì)Trkb，Src，Erk1/2和Akt的磷酸化水平?jīng)]有影響（P0.05）。 5. LY294002和PD98059不影響B(tài)DNF刺激的谷氨酸釋放，也不抑制Trkb，Src和PLCγ1的磷酸化水平（P0.05）。 結(jié)論： 1. BDNF通過Trkb/Src/PLCγ1信號(hào)通路誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元谷氨酸釋放。 2. BDNF作用下，Src被Trkb活化后，再促進(jìn)Trkb充分活化，充分活化后的Trkb通過提高PLCγ1的磷酸化水平促進(jìn)谷氨酸的釋放。
【圖文】：

37℃，20min。 稀釋的一抗，陰性對(duì)照用 PBS 代替一抗。水柔，防止細(xì)胞掉片），3×2min。 稀釋的二抗，避光孵育，37℃ 20min。柔，防止細(xì)胞掉片），3×2min。劑封片�；蚣す夤簿劢癸@微鏡觀察，拍照。GIT1 基因突變體、CaMKIIβ 基因 pIRES2-E 載體圖譜如下：

圖 1.2 體外培養(yǎng)至 10 天的皮層神經(jīng)元 （放大倍數(shù)×200）皮層神經(jīng)元的免疫熒光鑒定元行細(xì)胞爬片，并將培養(yǎng)至第 6 天的神經(jīng)元分別使-tubulin III(特異性識(shí)別神經(jīng)元樹突)和 NeuN(特異性要分布在神經(jīng)元核周，胞體和樹突起始部)。結(jié)果顯-tubulin III（圖 1.3A）和 NeuN(圖 1.3B)廣泛識(shí)別。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R338

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2647289