【摘要】：研究背景和目的： 突觸是神經(jīng)元間的特化結(jié)構，由突觸前膜，突觸間隙和突觸后膜組成，是維持神經(jīng)元相互聯(lián)系的基本單元。正確的突觸形成是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構和功能基礎，并受多種因素調(diào)節(jié)，如神經(jīng)生長因子，整合素及星型膠質(zhì)細胞等。BDNF (brainderived neurotropic factor,腦源性神經(jīng)生長因子)作為神經(jīng)因子家族重要成員之一，調(diào)節(jié)和維持神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能，如促進突觸形成。 GIT1(G protein coupled receptor kinase interacting protein-1, G蛋白偶聯(lián)受體激酶相關作用蛋白-1)是由多個結(jié)構域組成的穿梭蛋白，通過影響細胞骨架，調(diào)節(jié)受體內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運，細胞的粘附和遷移及突觸的發(fā)育和維持等。GTI1可分別通過整合素，ephrin及scribble等通路調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸的發(fā)育。CaMKII (calcium/calmodulin-dependent protein kinase,鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶)是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過自己激酶活性或結(jié)構特點調(diào)節(jié)突觸的形成和功能成熟。 本研究在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，，通過點突變，基因轉(zhuǎn)染及免疫共沉淀等技術，研究GIT1與CaMKIIβ是否參與BDNF誘導的突觸形成以及其中的分子機制。 方法： 1.分離，培養(yǎng)及鑒定大鼠原代皮層神經(jīng)元。 2. KN-93和GIT1-siRNA分別作用于神經(jīng)元，檢測對突觸形成的影響。 3.構建HA-GIT1-WT(wild type，野生型), HA-GIT1(第419絲氨酸突變?yōu)楸彼�，S419A)和Flag-CaMKIIβ質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染HEK293T細胞和原代皮層神經(jīng)元。 4.免疫印跡，免疫熒光及免疫共沉淀檢測技術檢測目的蛋白的表達和相互作用情況。 結(jié)果： 1.對培養(yǎng)至第6天的神經(jīng)元，分別使用神經(jīng)元特異性抗體β-tubulin III和NeuN進行細胞免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示兩個抗體染色均呈陽性。 2.與對照組相比，BDNF顯著促進突觸形成和p-CaMKIIthr286水平（P0.05）；KN-93和GIT1-siRNA能夠明顯抑制突觸形成（P0.05）；GIT1-siRNA明顯抑制CaMKII的磷酸化水平（P0.05）。 3.與GIT1-WT相比，在HEK293T細胞中，GIT1(S419A)與CaMKIIβ結(jié)合明顯下降（P0.05）；在皮層神經(jīng)元中，GIT1(S419A)與CaMKIIβ在神經(jīng)元突起處共定位明顯下降（P0.05）。 4.與GIT1-WT相比，GIT1(S419A)明顯抑制神經(jīng)元突觸形成。 結(jié)論： 1.在BDNF通路中，GIT1與CaMKIIβ參與皮層神經(jīng)元突觸的形成。 2.在BDNF通路中，GIT1(S419A)影響GIT1與CaMKIIβ的結(jié)合及CaMKIIβ激活； 研究背景與目的： BDNF不僅參與神經(jīng)元突觸的形成，還影響突觸形成后的功能。神經(jīng)遞質(zhì)釋放作為突觸重要功能之一，是神經(jīng)元之間聯(lián)系的物質(zhì)基礎。谷氨酸作為一種常見的神經(jīng)遞質(zhì)，其釋放也受BDNF的調(diào)控，但具體機制尚不明確。最近的研究表明BDNF與Src在調(diào)節(jié)神經(jīng)功能上存在相互關系。Src作為非受體酪氨酸激酶家族成員之一，通過作用于目的蛋白，參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)，但是目前，Src對谷氨酸釋的調(diào)控作用仍存在爭議。PLCγ1是PLC絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員之一，當其酪氨酸783位點磷酸化后被激活，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。Src和PLCγ1之間存在相互關系，如通過GIT1，Src參與PLCγ1的調(diào)節(jié)。但是在BDNF通路中，兩者的關系還不確定。本研究通過體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，研究BDNF誘導下谷氨酸釋放的信號通路，以及BDNF, Src和PLCγ1之間的關系。 方法： 1.分離和培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元。 2. Trkb, Src, PLCγ1, Akt和Erk1/2的特異性抑制劑K252a, PP2, U73122,LY294002和PD98059處理皮層神經(jīng)元，檢測BDNF刺激條件下的皮層神經(jīng)元谷氨酸釋放。 3.免疫印跡和免疫共沉淀技術檢測Trkb, Src, PLCγ1, Akt和Erk1/2的相互關系。 結(jié)果： 1. BDNF顯著增加谷氨酸釋放，同時明顯增強Trkb，Src，PLCγ1，Akt，和Erk1/2的磷酸化水平（P 0.05）。 2. K252a在抑制BDNF刺激條件下Trkb磷酸化和谷氨酸釋放的同時，明顯抑制Src，PLCγ1，Erk1/2和Akt的磷酸化水平（P 0.05）。 3. PP2降低BDNF刺激皮層神經(jīng)元的谷氨酸釋放（P0.05），抑制Trkb和PLC-γ1磷酸化水平（P0.05），但對Erk1/2和Akt的磷酸化水平卻沒有影響（P0.05）。 4. U73122抑制BDNF刺激皮層神經(jīng)元的谷氨酸釋放（P0.05），但對Trkb，Src，Erk1/2和Akt的磷酸化水平?jīng)]有影響（P0.05）。 5. LY294002和PD98059不影響B(tài)DNF刺激的谷氨酸釋放，也不抑制Trkb，Src和PLCγ1的磷酸化水平（P0.05）。 結(jié)論： 1. BDNF通過Trkb/Src/PLCγ1信號通路誘導皮層神經(jīng)元谷氨酸釋放。 2. BDNF作用下，Src被Trkb活化后，再促進Trkb充分活化，充分活化后的Trkb通過提高PLCγ1的磷酸化水平促進谷氨酸的釋放。
【圖文】：

37℃，20min。 稀釋的一抗，陰性對照用 PBS 代替一抗。水柔，防止細胞掉片），3×2min。 稀釋的二抗，避光孵育，37℃ 20min。柔，防止細胞掉片），3×2min。劑封片。或激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。GIT1 基因突變體、CaMKIIβ 基因 pIRES2-E 載體圖譜如下：

圖 1.2 體外培養(yǎng)至 10 天的皮層神經(jīng)元 （放大倍數(shù)×200）皮層神經(jīng)元的免疫熒光鑒定元行細胞爬片，并將培養(yǎng)至第 6 天的神經(jīng)元分別使-tubulin III(特異性識別神經(jīng)元樹突)和 NeuN(特異性要分布在神經(jīng)元核周，胞體和樹突起始部)。結(jié)果顯-tubulin III（圖 1.3A）和 NeuN(圖 1.3B)廣泛識別。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R338

【共引文獻】

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1 樊宇兵;王保芝;崔慧先;;肽類激素分泌機制的研究進展[J];解剖科學進展;2008年01期

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2 蔣俊;在hTau小鼠及I型糖尿病小鼠中激活EphB2受體降低tau磷酸化的機制研究[D];華中科技大學;2013年

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本文編號：2647289