【摘要】：第一章 地塞米松誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡體外模型建立及形態(tài)學(xué)研究 目的：建立地塞米松(DEX)誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡體外模型并且進(jìn)行凋亡形態(tài)學(xué)研究。方法：以地塞米松誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡為模型，通過流式細(xì)胞術(shù)、電鏡和熒光顯微鏡測定模型的穩(wěn)定性。結(jié)果：僅在完全RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下小鼠胸腺細(xì)胞自發(fā)凋亡百分率為(2.90±0.62)％，在2.5 μmol／L DEX誘導(dǎo)下，3小時(shí)培養(yǎng)組(12.70±2.44)％、6小時(shí)培養(yǎng)組(53.55±4.59)％發(fā)生了細(xì)胞凋亡；在1μmol／L DEX誘導(dǎo)下，小鼠胸腺細(xì)胞在3h、5h和7h凋亡比率分別為(18.43±0.30)％、(37.85±1.46)％和(62.53±1.81)％，對照組分別為(4.05±0.29)％、(4.81±0.24)％和(7.77±0.31)％，組間差異顯著(p＜0.01)；相同時(shí)點(diǎn)下，DEX組壞死比率分別為(1.20±0.08)％、(3.99±0.31)％和(6.46±0.81)％，對照組分別為(0.93±0.10)％、(1.27±0.22)％和(1.55±0.19)％，組間差異顯著(p＜0.01)。形態(tài)學(xué)和熒光顯微觀察到典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。結(jié)論：建立了體外DEX誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡定量模型，并且發(fā)現(xiàn)影響模型穩(wěn)定性的主要因素包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、溫度、機(jī)械損傷和操作時(shí)間等。 第二章 地塞米松誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡過程中MAPK相關(guān)信息通路研究 目的：研究在DEX影響小鼠胸腺細(xì)胞MAPK相關(guān)信號變化特點(diǎn)，以進(jìn)一步探討DEX誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡過程中的作用機(jī)制。 方法：分別用終濃度為10、25和50μmol／L的ERK1／2特異性阻斷劑PD98059(PD)以及10μmol／L的p38特異性阻斷劑SB203580(SB)單獨(dú)和聯(lián)合1μmol／L的DEX作用小鼠胸腺細(xì)胞，并通過Annexin V-FITC／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)測定3 h、5 h和7 h凋亡和壞死細(xì)胞比率；以終濃度1μmol／L的DEX誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡，利用SDS-PAGE及Western blot檢測0、30、60和180 min細(xì)胞內(nèi)ERK1／2、p38、JNK1／2、c-Myc和caspase-3信號變化特點(diǎn)。 結(jié)果：分別在終濃度10、25和50μmol／L的PD單獨(dú)刺激下，小鼠胸腺細(xì)胞凋亡比例在3、5和7 h時(shí)點(diǎn)均顯著高于對照組(p＜0.01)，而且表現(xiàn)出PD劑量依賴型誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡趨勢；各組壞死比例均高于對照組。 在終濃度10、25和50μmol／L PD和1μmol／L DEX聯(lián)合刺激下，小鼠胸腺 細(xì)胞凋亡壞死進(jìn)程明顯提高，結(jié)果顯示PD加速DEX誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡。 SB10林mol/L單獨(dú)刺激下，小鼠胸腺細(xì)胞凋亡比例在3、5和7h時(shí)點(diǎn)均顯 著高于對照組(p0.01);同時(shí)小鼠胸腺細(xì)胞壞死比例在3在相同時(shí)點(diǎn)下均高于 對照組。SB10林mol幾和1林mol/L DEX聯(lián)合刺激下，小鼠胸腺細(xì)胞凋亡和壞死 比例在3、5和7h時(shí)點(diǎn)分別為均高于DEX組。結(jié)果顯示SB加速DEX誘導(dǎo)小鼠 胸腺細(xì)胞凋亡 W亡stem blot結(jié)果顯示，對照組胸腺細(xì)胞ERKI/2總量相對豐富而且穩(wěn)定，基 本上不隨時(shí)間變化而變化，不僅如此，磷酸化激活的ERKI/2(pERKI/2)含量 隨時(shí)間變化也相對恒定。在DEX存在的條件下，ERKI/2總量相對有所下降，尤 其是ERKI比較明顯;pERKI/2含量在DEX的刺激后立即顯著下降。 對照組p38含量隨著培養(yǎng)時(shí)間增加呈不明顯變化趨勢;而DEX組p38呈逐 漸減少趨勢。 對照組JNKI隨著時(shí)間變化呈逐漸增加趨勢，而爪K2含量變化不明顯。DEX 組每個(gè)時(shí)點(diǎn)州Kl/2含量均低于對照組，而且JNKZ呈明顯的隨培養(yǎng)時(shí)間延長而 減少趨勢。 對照組在omin即可檢測到c一Myc的明顯表達(dá)，30min略見增多，lh和3h 呈微弱的下降趨勢;而DEX組c一Myc在30 min明顯增強(qiáng)，lh和3h顯著減弱， 但均高于對照組。 對照組caspase一3在O和30 min表達(dá)不明顯，而在lh和3h有著較為明顯 的表達(dá);DEX組easpase一3在30 min最多，lh和3h顯著減少。 結(jié)論:本研究結(jié)果提示DEX對MAPK三種激酶表達(dá)和激活的阻斷作用可能 與其誘導(dǎo)凋亡有著密切的關(guān)系。在DEX誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)c一Myc介 導(dǎo)的細(xì)胞凋亡模式，，而且在該過程中c一Myc、ERKI/2和casPase一3信號可能存在 著反饋抑制調(diào)節(jié)的可能性。 第三章地塞米松誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡過程中線粒體膜電勢和 鈣離子變化研究 目的:研究DEX誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡過程中線粒體膜電勢(△平m)和鈣離子 ([eaZ+]*)變化特點(diǎn)。 方法:以終濃度1娜ol幾的DEX刺激小鼠胸腺細(xì)胞，通過JC一1染色流式細(xì)胞 術(shù)，在。、z、3、5、7、9、一l、24和27h時(shí)點(diǎn)分別檢測小鼠胸腺細(xì)胞平均J一眼『egate (瓦2)和平均J一monomer(瓦l)含量，并計(jì)算線粒體膜電勢(瓦2/瓦1)。利 用激光掃描共聚焦分析測定細(xì)胞內(nèi)[C擴(kuò)勺i。利用cFDA一sE染色技術(shù)評價(jià)sh時(shí) 點(diǎn)細(xì)胞骨架蛋白變化。 結(jié)果:本研究中，小鼠胸腺細(xì)胞離體之后元1所反映的線粒體質(zhì)量迅速下降， 至sh對照組達(dá)到平臺期(913.38士70.11)，然后緩慢下降到27h的(622.80士 22.81)。DEX組瓦l在lh和3h與對照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，而從sh (660.91土72.95)開始顯著低于對照組(P0.01)，并且隨培養(yǎng)時(shí)間延長呈下降 趨勢，至27h的(309.70士53.35)。對照組和DEx組瓦2隨培養(yǎng)延長而呈降低趨 勢。l一gh，對照組和DEX的△wm沒有顯著差異(P0.05)。而在11、24和27 h，對照組△wm分別為(256.41士21.59)、(214.14士23.21)和(146.14士17.97)， 而
【圖文】：

tof叮oFand叮。護(hù)，“，‘toERK一瓜pathw叮ofmousethymoeDEXGF和aFGF27一54對DEx刺激下小鼠胸腺細(xì)胞ERKI/2信號aFGF27一‘54對p38信號的影響EX組結(jié)果見第三章圖4.)54+DEX組和aFoF+nEX組p38在o一30min呈明顯下顯示出上升趨勢，而且該時(shí)點(diǎn)p38含量顯著高于Din的p38含量下降到與接近DEX組水平(圖4.)。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2646539