發(fā)布時(shí)間：2020-04-30 20:41

【摘要】： 腸上皮是實(shí)現(xiàn)腸道消化、免疫、內(nèi)分泌等功能的主要組織細(xì)胞，也是構(gòu)筑腸道粘膜屏障的主要成分，同時(shí)它對(duì)輻射敏感。作為腹腔惡性腫瘤治療主要手段之一，電離輻射對(duì)正常小腸上皮細(xì)胞具有毒副作用，限制了其在治療上的應(yīng)用。超過(guò)一定劑量照射可形成的腸型放射病，導(dǎo)致病死率極高，故對(duì)輻射誘導(dǎo)的小腸上皮損傷的研究受到極大的關(guān)注。 為深入闡明電離輻射致腸上皮損傷的分子機(jī)制，尋找促進(jìn)腸上皮損傷修復(fù)和具有輻射保護(hù)作用的蛋白質(zhì)，本研究以離體培養(yǎng)的IEC-6細(xì)胞（正常大鼠空腸上皮細(xì)胞）和小鼠9Gyγ-射線全身照射所致腸型放射病為模型，采用雙向電泳技術(shù)分別比較了IEC-6細(xì)胞和小鼠小腸上皮細(xì)胞照射前后蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，通過(guò)MALDI-TOF-MS鑒定雙向電泳圖譜上差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，采用Western blot和RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了部分驗(yàn)證，并集中研究了兩個(gè)差異蛋白質(zhì)PrxI和ERP29在電離輻射中的作用。取得了如下的主要結(jié)果： 一、 損傷模型的確定 利用IEC-6細(xì)胞作為體外研究模型是合理可行的。首先根據(jù)IEC-6細(xì)胞在不同照射劑量照射（15-35Gy）和照射后不同時(shí)相（1-3d）細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡量來(lái)確定合適的照射劑量。結(jié)果顯示：利用25Gy照射后1天的細(xì)胞來(lái)研究細(xì)胞對(duì)電離輻射的反應(yīng)是較為適合的。體內(nèi)研究是以腸型放射病為模型。采用不同劑量的γ-射線（7-10Gy）全身照射小鼠，復(fù)制腸型放射病模型。結(jié)果表明：9Gy照射可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)典型的腸型放射病。9Gy照射3h后，小腸上皮隱窩高度和絨毛高度未見(jiàn)明顯縮短，但細(xì)胞核分裂相消失，呈嚴(yán)重的損傷性改變；照射后72h，絨毛明顯縮短，隱窩明顯增高，表明有大量再生上皮細(xì)胞，以增殖修復(fù)為主。因此，該條件下小鼠能存活一定時(shí)間，其早期輻射損傷嚴(yán)重，后期修復(fù)明顯，是較為適合的研究模型。利用含尿素的細(xì)胞裂解液能夠較為完全地提取細(xì)胞的總蛋白，適合雙向電泳制備蛋白樣品的要求。 二、 IEC-6細(xì)胞照射前后蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異 采用寬pH范圍3-10L的干膠條（IPG、18cm），上樣量為500-1000(g，聚焦6-8h，千伏時(shí)不低于32000。各選取3張照射前后的蛋白圖譜，，應(yīng)用PDQUEST軟件進(jìn)行圖像分析，在pH3-10L和Mr 14000-97400Da范圍內(nèi)檢測(cè)蛋白。電泳圖像經(jīng)過(guò)PDQuest處理后，結(jié)果表明：在正常IEC-6細(xì)胞中檢測(cè)到608±40個(gè)蛋白點(diǎn)，細(xì)胞照射后的樣 WP=9 品中檢測(cè)到595±31個(gè)蛋白點(diǎn)，其中匹配的蛋白點(diǎn)為396個(gè)，電泳圖譜的相關(guān)系數(shù)為0.78。然后，選擇了部分差異明顯的蛋白點(diǎn)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定。在未匹配的蛋白點(diǎn)中選擇清晰、較濃的點(diǎn)做好標(biāo)記，從凝膠上準(zhǔn)確切割后進(jìn)行脫色、酶解、肽片段提取，并測(cè)定肽質(zhì)量指紋圖譜。根據(jù)質(zhì)譜圖中的肽片段質(zhì)量進(jìn)行檢索，再結(jié)合雙向電泳中蛋白點(diǎn)的表觀分子量、等電點(diǎn)進(jìn)行綜合分析。本實(shí)驗(yàn)共對(duì)16個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了肽質(zhì)量指紋圖譜分析，其中11個(gè)蛋白點(diǎn)得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，這包括一些與代謝、自由基清除、細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白。其中，電離輻射后降低的蛋白質(zhì)包括：STRESS-70 PROTEIN，Tubulin beta-5 chain，ATP SYNTHASE BETA CHAIN，Vimentin，PDZ and LIM domain protein 1等；而PEROXIREDOXIN 1，ERP29，Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，RGS4，Aldehyde dehydro- genase（mitochondrial precursor）等在照射后升高。在此基礎(chǔ)上，對(duì)其中部分蛋白質(zhì)進(jìn)行了驗(yàn)證。Western blot結(jié)果顯示：STRESS-70 PROTEIN在照射后確實(shí)被降低了。RT-PCR結(jié)果顯示：ERP29基因在照射后基因表達(dá)增高，這與其蛋白質(zhì)在照射后升高相吻合。 三、 小鼠全身照射前后小腸上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異 在9Gy的劑量照射后，分離小腸上皮細(xì)胞，并采用Percoil細(xì)胞分離液對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行了純化，得到相對(duì)較為單純的腸上皮細(xì)胞。利用含尿素的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞的總蛋白，對(duì)同一樣品進(jìn)行多次電泳�？偟鞍椎姆植寄Ｊ椒浅Ｏ嗨疲旱鞍踪|(zhì)斑點(diǎn)相對(duì)集中于pH4~7，極端酸性蛋白與堿性蛋白數(shù)量較少；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量集中于（15~100）×103，超出此范圍的斑點(diǎn)較少。采用PDQuest軟件比較各組圖譜，在正常對(duì)照組、照射后3h組以及照射后72h組分別檢測(cè)到638±39、566±32和591±29個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，總蛋白質(zhì)點(diǎn)在照射后有所減少。照射后3h組與正常對(duì)照組相比有360個(gè)點(diǎn)相匹配，電泳圖譜的平均相關(guān)系數(shù)為0.78；照射后72h組與正常對(duì)照組相比有312個(gè)點(diǎn)相匹配，電泳圖譜的平均相關(guān)系數(shù)為0.82；照后3h組與照后72h組相比有282個(gè)相匹配，電泳圖譜的平均相關(guān)系數(shù)為0.76。不匹配的斑點(diǎn)主要為低豐度蛋白質(zhì)。在差異的蛋白點(diǎn)中選擇清晰、較濃的點(diǎn)做好標(biāo)記，從凝膠上準(zhǔn)確切割后進(jìn)行脫色、酶解、肽片段的提取，并測(cè)定肽質(zhì)量指紋圖譜。根據(jù)肽質(zhì)量指紋圖中肽片段的質(zhì)量數(shù)進(jìn)行檢索，再結(jié)合蛋白質(zhì)點(diǎn)的表觀分子量、進(jìn)行綜合分析。共對(duì)28個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了肽質(zhì)量指紋圖譜分析，19個(gè)蛋白點(diǎn)得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，這包括一些與代謝、過(guò)氧化應(yīng)急、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白。其中，電離輻射后降低的蛋白質(zhì)包括：Transforming protein RhoB，Antioxidant Protein 2，Q8VC72，O70619等；而PEROXI- REDOXIN 1，ERP29，Rho GDP-dissociation inhibitor 1，Alpha enolase，Prolactin receptor precursor，Glutathione S-transferase P2，Truncated
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第三軍醫(yī)大學(xué)博士研究生論文白質(zhì)樣品的制備的制備是雙向電泳的關(guān)鍵步驟。我們欲對(duì) IEC-6 細(xì)胞的總蛋白進(jìn)可能得到細(xì)胞的各種成分，特別是結(jié)構(gòu)蛋白等不溶性蛋白。其中液提取蛋白是一個(gè)重要的的因素。為了達(dá)到最大的蛋白溶解程度解液用量（100ul），加入不同量的細(xì)胞制備蛋白質(zhì)樣品，測(cè)定蛋白2。

圖 20：MTT 測(cè)定 IEC-6 細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染后進(jìn)行電離輻射的細(xì)胞增1: 照后 24h 2: 照后 48hSG5-PrxI、pAVU6-PrxI 轉(zhuǎn)染 IEC-6 細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞在照射后細(xì)胞凋亡將 pSG5、pSG5-PrxI 和 pAVU6-PrxI 轉(zhuǎn)染 IEC-6 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 24h 進(jìn)繼續(xù)培養(yǎng) 12h。收集細(xì)胞經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯 pSG5 后 IEC-6 細(xì)胞凋亡率 0.24%，pSG5-PrxI 轉(zhuǎn)染后 0%,而轉(zhuǎn)染16%。初步說(shuō)明高表達(dá) PrxI 可以抑制照射后細(xì)胞的凋亡，而抑制該的發(fā)生。SG5-ERP29、pAVU6-ERP29 轉(zhuǎn)染 IEC-6 細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞在照射后存我們將 IEC-6 細(xì)胞接種于 96 孔板后進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后 24h 進(jìn)和 48h 后進(jìn)行 MTT 測(cè)定。結(jié)果顯示：照射后 24h 和 48h，轉(zhuǎn)染 U6-ERP29 與對(duì)照質(zhì)粒 pSG5 沒(méi)有顯著性差別（表 10）。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2646158