【摘要】： 腸上皮是實現(xiàn)腸道消化、免疫、內(nèi)分泌等功能的主要組織細胞，也是構(gòu)筑腸道粘膜屏障的主要成分，同時它對輻射敏感。作為腹腔惡性腫瘤治療主要手段之一，電離輻射對正常小腸上皮細胞具有毒副作用，限制了其在治療上的應(yīng)用。超過一定劑量照射可形成的腸型放射病，導(dǎo)致病死率極高，故對輻射誘導(dǎo)的小腸上皮損傷的研究受到極大的關(guān)注。 為深入闡明電離輻射致腸上皮損傷的分子機制，尋找促進腸上皮損傷修復(fù)和具有輻射保護作用的蛋白質(zhì)，本研究以離體培養(yǎng)的IEC-6細胞（正常大鼠空腸上皮細胞）和小鼠9Gyγ-射線全身照射所致腸型放射病為模型，采用雙向電泳技術(shù)分別比較了IEC-6細胞和小鼠小腸上皮細胞照射前后蛋白質(zhì)表達的差異，通過MALDI-TOF-MS鑒定雙向電泳圖譜上差異的蛋白質(zhì)點，采用Western blot和RT-PCR技術(shù)進行了部分驗證，并集中研究了兩個差異蛋白質(zhì)PrxI和ERP29在電離輻射中的作用。取得了如下的主要結(jié)果： 一、 損傷模型的確定 利用IEC-6細胞作為體外研究模型是合理可行的。首先根據(jù)IEC-6細胞在不同照射劑量照射（15-35Gy）和照射后不同時相（1-3d）細胞增殖以及細胞凋亡量來確定合適的照射劑量。結(jié)果顯示：利用25Gy照射后1天的細胞來研究細胞對電離輻射的反應(yīng)是較為適合的。體內(nèi)研究是以腸型放射病為模型。采用不同劑量的γ-射線（7-10Gy）全身照射小鼠，復(fù)制腸型放射病模型。結(jié)果表明：9Gy照射可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)典型的腸型放射病。9Gy照射3h后，小腸上皮隱窩高度和絨毛高度未見明顯縮短，但細胞核分裂相消失，呈嚴(yán)重的損傷性改變；照射后72h，絨毛明顯縮短，隱窩明顯增高，表明有大量再生上皮細胞，以增殖修復(fù)為主。因此，該條件下小鼠能存活一定時間，其早期輻射損傷嚴(yán)重，后期修復(fù)明顯，是較為適合的研究模型。利用含尿素的細胞裂解液能夠較為完全地提取細胞的總蛋白，適合雙向電泳制備蛋白樣品的要求。 二、 IEC-6細胞照射前后蛋白質(zhì)表達譜的差異 采用寬pH范圍3-10L的干膠條（IPG、18cm），上樣量為500-1000(g，聚焦6-8h，千伏時不低于32000。各選取3張照射前后的蛋白圖譜，，應(yīng)用PDQUEST軟件進行圖像分析，在pH3-10L和Mr 14000-97400Da范圍內(nèi)檢測蛋白。電泳圖像經(jīng)過PDQuest處理后，結(jié)果表明：在正常IEC-6細胞中檢測到608±40個蛋白點，細胞照射后的樣 WP=9 品中檢測到595±31個蛋白點，其中匹配的蛋白點為396個，電泳圖譜的相關(guān)系數(shù)為0.78。然后，選擇了部分差異明顯的蛋白點進行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定。在未匹配的蛋白點中選擇清晰、較濃的點做好標(biāo)記，從凝膠上準(zhǔn)確切割后進行脫色、酶解、肽片段提取，并測定肽質(zhì)量指紋圖譜。根據(jù)質(zhì)譜圖中的肽片段質(zhì)量進行檢索，再結(jié)合雙向電泳中蛋白點的表觀分子量、等電點進行綜合分析。本實驗共對16個蛋白點進行了肽質(zhì)量指紋圖譜分析，其中11個蛋白點得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，這包括一些與代謝、自由基清除、細胞骨架相關(guān)的蛋白。其中，電離輻射后降低的蛋白質(zhì)包括：STRESS-70 PROTEIN，Tubulin beta-5 chain，ATP SYNTHASE BETA CHAIN，Vimentin，PDZ and LIM domain protein 1等；而PEROXIREDOXIN 1，ERP29，Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，RGS4，Aldehyde dehydro- genase（mitochondrial precursor）等在照射后升高。在此基礎(chǔ)上，對其中部分蛋白質(zhì)進行了驗證。Western blot結(jié)果顯示：STRESS-70 PROTEIN在照射后確實被降低了。RT-PCR結(jié)果顯示：ERP29基因在照射后基因表達增高，這與其蛋白質(zhì)在照射后升高相吻合。 三、 小鼠全身照射前后小腸上皮細胞蛋白質(zhì)表達譜的差異 在9Gy的劑量照射后，分離小腸上皮細胞，并采用Percoil細胞分離液對上皮細胞進行了純化，得到相對較為單純的腸上皮細胞。利用含尿素的細胞裂解液提取細胞的總蛋白，對同一樣品進行多次電泳。總蛋白的分布模式非常相似：蛋白質(zhì)斑點相對集中于pH4~7，極端酸性蛋白與堿性蛋白數(shù)量較少；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量集中于（15~100）×103，超出此范圍的斑點較少。采用PDQuest軟件比較各組圖譜，在正常對照組、照射后3h組以及照射后72h組分別檢測到638±39、566±32和591±29個蛋白質(zhì)點，總蛋白質(zhì)點在照射后有所減少。照射后3h組與正常對照組相比有360個點相匹配，電泳圖譜的平均相關(guān)系數(shù)為0.78；照射后72h組與正常對照組相比有312個點相匹配，電泳圖譜的平均相關(guān)系數(shù)為0.82；照后3h組與照后72h組相比有282個相匹配，電泳圖譜的平均相關(guān)系數(shù)為0.76。不匹配的斑點主要為低豐度蛋白質(zhì)。在差異的蛋白點中選擇清晰、較濃的點做好標(biāo)記，從凝膠上準(zhǔn)確切割后進行脫色、酶解、肽片段的提取，并測定肽質(zhì)量指紋圖譜。根據(jù)肽質(zhì)量指紋圖中肽片段的質(zhì)量數(shù)進行檢索，再結(jié)合蛋白質(zhì)點的表觀分子量、進行綜合分析。共對28個蛋白點進行了肽質(zhì)量指紋圖譜分析，19個蛋白點得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，這包括一些與代謝、過氧化應(yīng)急、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白。其中，電離輻射后降低的蛋白質(zhì)包括：Transforming protein RhoB，Antioxidant Protein 2，Q8VC72，O70619等；而PEROXI- REDOXIN 1，ERP29，Rho GDP-dissociation inhibitor 1，Alpha enolase，Prolactin receptor precursor，Glutathione S-transferase P2，Truncated
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)博士研究生論文白質(zhì)樣品的制備的制備是雙向電泳的關(guān)鍵步驟。我們欲對 IEC-6 細胞的總蛋白進可能得到細胞的各種成分，特別是結(jié)構(gòu)蛋白等不溶性蛋白。其中液提取蛋白是一個重要的的因素。為了達到最大的蛋白溶解程度解液用量（100ul），加入不同量的細胞制備蛋白質(zhì)樣品，測定蛋白2。

圖 20：MTT 測定 IEC-6 細胞進行基因轉(zhuǎn)染后進行電離輻射的細胞增1: 照后 24h 2: 照后 48hSG5-PrxI、pAVU6-PrxI 轉(zhuǎn)染 IEC-6 細胞后對細胞在照射后細胞凋亡將 pSG5、pSG5-PrxI 和 pAVU6-PrxI 轉(zhuǎn)染 IEC-6 細胞，轉(zhuǎn)染后 24h 進繼續(xù)培養(yǎng) 12h。收集細胞經(jīng)過流式細胞儀測定細胞凋亡率，結(jié)果顯 pSG5 后 IEC-6 細胞凋亡率 0.24%，pSG5-PrxI 轉(zhuǎn)染后 0%,而轉(zhuǎn)染16%。初步說明高表達 PrxI 可以抑制照射后細胞的凋亡，而抑制該的發(fā)生。SG5-ERP29、pAVU6-ERP29 轉(zhuǎn)染 IEC-6 細胞后對細胞在照射后存我們將 IEC-6 細胞接種于 96 孔板后進行基因轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后 24h 進和 48h 后進行 MTT 測定。結(jié)果顯示：照射后 24h 和 48h，轉(zhuǎn)染 U6-ERP29 與對照質(zhì)粒 pSG5 沒有顯著性差別（表 10）。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2646158