【摘要】：天然免疫是機(jī)體防御病原體入侵的第一道有效防線,病毒、細(xì)菌等致病性病原微生物一旦入侵機(jī)體,將迅速啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫應(yīng)答,觸發(fā)炎癥反應(yīng)。在天然免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞等對(duì)病原微生物的識(shí)別過程中,Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)作為一種模式識(shí)別受體發(fā)揮著重要作用。TLRs特異性識(shí)別病原體中特定的分子結(jié)構(gòu),激活其下游的MyD88或TRIF依賴的信號(hào)通路,激活MAPK、NF-κB或者IRF3信號(hào),最終激活天然免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和I型干擾素,構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵的第一道屏障。MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的長度約為21～23個(gè)bp的非編碼寡聚核苷酸,其功能主要是通過與mlRNA的3’非編碼區(qū)(3'UTR)特異靶位點(diǎn)相互作用從而負(fù)向調(diào)控aRNA的翻譯。miRNA參與調(diào)控了多種生物學(xué)過程,如生長、發(fā)育、分化、腫瘤的發(fā)生等。同樣,niRNA對(duì)免疫應(yīng)答和免疫細(xì)胞的分化和功能也起著十分重要的調(diào)控作用。已有多篇關(guān)于miRNA參與調(diào)控天然免疫應(yīng)答的相關(guān)報(bào)道,如miRNA-146、miRNA-101分別在炎癥反應(yīng)中起著負(fù)向和正向的調(diào)控作用。 miRNA-92a已被報(bào)道在腫瘤和血管生成方面起著重要作用,但其在天然免疫中的作用和意義未見報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)用多種TLR配體,如TLR2、TLR3、TLR4的配體LPS, PGN,PolyI:C分別刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞后,niR-92a的表達(dá)水平在短時(shí)間內(nèi)下降。我們進(jìn)一步檢測了miR-92a在MyD88或TRIF缺失的巨噬細(xì)胞中經(jīng)TLR配體刺激后的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)niR-92a的表達(dá)下降同時(shí)由TLR信號(hào)途徑中的MyD88,TRIF通路所誘導(dǎo)。之后,我們將合成的siRNA轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞中,來模擬內(nèi)源性miR-92a的功能或特異性抑制其作用來進(jìn)一步研究niR-92a的功能。研究發(fā)現(xiàn)miR-92a的過表達(dá)可明顯降低LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-a和IL-6mRNA和蛋白表達(dá)水平,同時(shí)減低了JNK和C-JUN的磷酸化水平。相反地,抑制miR-92a功能后,巨噬細(xì)胞TNF-a和IL-6的表達(dá)增加,JNK/C-JUN信號(hào)通路增強(qiáng)。由于miRNA主要通過調(diào)控靶基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能,我們進(jìn)一步通過miRNA靶點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站來尋找潛在的使niR-92a發(fā)揮上述功能的靶點(diǎn)分子。熒光素酶報(bào)告基因和蛋白檢測等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明niR-92a可直接靶向抑制MKK4的表達(dá),而MKK4是TLR信號(hào)中促進(jìn)JNK活化的關(guān)鍵中間信號(hào)分子。接著,我們進(jìn)一步證實(shí)了MKK4的功能,干擾MKK4后,JNK/C-JUN信號(hào)通路減弱,繼而降低炎癥因子TNF-a和IL-6的表達(dá)和分泌。 綜上所述,miR-92a在巨噬細(xì)胞TLR配體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中,可通過靶向抑制MKK4,從而降低JNK/C-JUN信號(hào)通路的活化,最終抑制炎癥因子的表達(dá)。該研究結(jié)果為巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制增添了新的認(rèn)識(shí),并可能為炎癥引起的免疫相關(guān)性疾病的診治提供新的靶標(biāo)。 TLRs(Toll—like receptors)是一類重要的病原分子模式PAMPs識(shí)別受體,在天然細(xì)胞如巨噬細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞中廣泛表達(dá)。TLRs特異性識(shí)別病原體中特定的分子結(jié)構(gòu),激活其下游的MyD88或TRIF依賴的信號(hào)通路,激活MAPK.NF-κB或者IRF3信號(hào),最終激活天然免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素。micrRNAs(miRNAs)是一種進(jìn)化上保守的長約21～23個(gè)核苷酸的非編碼RNA,其通過與靶基因的3’非翻譯區(qū)間結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá)。miRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)控機(jī)制同樣,同樣對(duì)免疫應(yīng)答和免疫細(xì)胞的分化和功能也起著十分重要的調(diào)控作用。 由于在脂類代謝方面的關(guān)鍵作用,miR-33最近幾年受到了研究者的廣泛關(guān)注,但其在天然免疫中的作用和意義尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)用多種TLR配體,如TLR2、TLR3.TLR4的配體HKLM,LPS,PolyI:C分別刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞后,miR-33的表達(dá)水平在刺激后期下降。我們進(jìn)一步檢測了miR-33在MyD88或TRIF缺失的巨噬細(xì)胞中經(jīng)TLR配體刺激后的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)miR-33的表達(dá)下降主要受到TLR信號(hào)途徑中的TRIF通路所調(diào)控。之后,我們將合成的siRNA轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞中,來模擬內(nèi)源性miR-33的功能或特異性抑制其作用來作進(jìn)一步的研究。研究發(fā)現(xiàn)miR-33的過表達(dá)可明顯增加LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-a和IL-6mRNA和蛋白表達(dá)水平。相反地,抑制miR-33后,巨噬細(xì)胞TNF-a和IL-6的表達(dá)下降。膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1和ABCG1被報(bào)道是miR-33的直接靶點(diǎn),且其在炎癥反應(yīng)中起著負(fù)向調(diào)控的作用。由此,我們猜測miR-33可通過靶基因ABCA1和ABCG1對(duì)炎癥起到調(diào)控作用。為此,我們首先驗(yàn)證了在原代巨噬細(xì)胞中,miR-33可直接作用于ABCA1和ABCGl,使其mRNA和蛋白水平下降。ABCA1-/-.ABCGl-/-小鼠來源的巨噬細(xì)胞中,過表達(dá)miR-33對(duì)炎癥因子的正向調(diào)控作用減弱。同時(shí),巨噬細(xì)胞內(nèi)ABCA1和ABCG1的表達(dá)增加也減弱了miR-33對(duì)炎癥因子的正向調(diào)控作用。接著,我們進(jìn)一步研究了miR-33調(diào)控TLR觸發(fā)的炎癥應(yīng)答的機(jī)制。ABCA1和ABCG1協(xié)同負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇到細(xì)胞外,從而降低細(xì)胞膜內(nèi)游離膽固醇的含量,進(jìn)而影響脂筏的含量,抑制TLR信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此,我們檢測了miR-33對(duì)細(xì)胞膜脂筏含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-33可增加細(xì)胞膜內(nèi)的脂筏含量,從而增強(qiáng)TLR信號(hào),主要是NF-κB信號(hào),最終促進(jìn)炎癥因子TNF-a和IL-6的表達(dá)和分泌。脂筏結(jié)構(gòu)干擾化合物處理細(xì)胞后,miR-33對(duì)炎癥因子的調(diào)控作用減弱,進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-33可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂筏的含量來調(diào)控TLR觸發(fā)的炎癥應(yīng)答。另一方面,miR-33也可抑制抗炎因子IL-10的表達(dá),協(xié)同促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)。 綜上所述,在巨噬細(xì)胞中,可能存在以下調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：LPS刺激后,TRIF信號(hào)通路可降低miR-33的表達(dá),niR-33的下降釋放了對(duì)靶基因ABCA1和ABCG1的抑制,從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的外流,膜內(nèi)脂筏含量降低,TLR信號(hào)減弱。另一方面,miR-33下降后,抗炎因子IL-10的表達(dá)增加,兩者協(xié)同抑制炎癥因子的表達(dá)。本課題的研究結(jié)果為巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制增添了新的認(rèn)識(shí),提示了膽固醇與炎癥之間存在的關(guān)系,為炎癥引起的免疫相關(guān)性疾病的診治提供新的思路。 Interleukin9(IL-9)起初最為一種T細(xì)胞和肥大細(xì)胞的生長因子被研究者所認(rèn)識(shí)。近十幾年的研究揭示了IL-9更多的生物學(xué)功能以及產(chǎn)生機(jī)制,引起了研究者的廣泛關(guān)注。初始CD4+T細(xì)胞在體外TGF-β和IL-4培養(yǎng)下能高分泌IL-9,分化成Th9細(xì)胞。 IL-9通過與IL-9受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)活性。IL-9能促進(jìn)T細(xì)胞和肥大生長之外,對(duì)B細(xì)胞、固有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等的生長和功能也具有調(diào)控作用。IL-9能夠促進(jìn)LPS誘導(dǎo)激活的人巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌TGF-p,并降低TNF-a的表達(dá),從而抑制突發(fā)性氧化作用。IL-9也能抑制APC誘導(dǎo)的Thl型免疫應(yīng)答。 IL-9在各類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不同的作用。在超敏反應(yīng)和自身免疫性病中,IL-9作為一種炎癥分子,能加速疾病的發(fā)展；而在寄生蟲感染和皮膚移植中,IL-9能促進(jìn)機(jī)體清除病原體以及移植物免疫耐受的形成。巨噬細(xì)胞作為炎癥應(yīng)答的主要細(xì)胞,在病原體感染和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。病原菌都有一些保守的特征性分子,稱為病原菌相關(guān)分子模式PAMPs (pathogen-associated molecular patterns)。細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體PRRs通過識(shí)別病原菌的PAMPs而激發(fā)免疫反應(yīng)。一旦識(shí)別了病原體,PRRs就會(huì)激活其下游一系列的信號(hào)通路,活化天然免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素等細(xì)胞因子,從而啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答。而目前,IL-9對(duì)PAMPs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答的調(diào)控作用尚未清楚。因此,本研究的目的主要在于了解IL-9是否參與該過程,從而進(jìn)一步了解IL-9在炎癥疾病中作用。 利用IL-9基因敲除小鼠,我們發(fā)現(xiàn),IL-9-/-小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞在各類PAMPs刺激下,炎癥因子TNF-α,IL-6,IL-1β的表達(dá)顯著下降。之后,我們單獨(dú)用IL-9處理原代巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)高濃度的IL-9能誘導(dǎo)原代巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6,TNF-α同時(shí),用低濃度的IL-9處理能夠增強(qiáng)原代巨噬細(xì)胞對(duì)PAMPs誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生�？梢�,IL-9在巨噬細(xì)胞PAMPs激活的信號(hào)中發(fā)揮著一定的調(diào)控作用。我們正在進(jìn)一步研究IL-9對(duì)巨噬細(xì)胞接受PAMPs刺激,活化TLR信號(hào)過程的調(diào)控效應(yīng)及其細(xì)胞和分子機(jī)制,以及這樣的調(diào)控方式在各類炎癥和感染疾病發(fā)生發(fā)展中的作用,希望能為相關(guān)疾病的診治提供新的方向和視角。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2645955