【摘要】： 維生素A(視黃醇)及其生物活性衍生物(retinoids,類維生素A)對細胞的分化、增殖、及胚胎的發(fā)育具有重要的作用。此外，維生素A對免疫系統(tǒng)的影響也日益被人們所關(guān)注。維生素A，尤其是其體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物視黃酸(retinoic acid，RA)，對T、B淋巴細胞均有作用，RA可顯著促進金黃色葡萄球菌Cowan I株(SAC)活化后的臍血單個核細胞IgM的生成，但對成人外周血單個核細胞IgM的生成作用不明顯，這提示在作用機制上存在隨年齡增長或生長發(fā)育而異的特殊規(guī)律，但尚未見有關(guān)研究報道。研究表明，視黃酸通過與視黃酸受體(Retinoic Acid Receptor, RARs)結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其生物學(xué)作用。T淋巴細胞是組成免疫系統(tǒng)的重要的免疫細胞，在抗細胞內(nèi)病原體感染以及輔助B細胞產(chǎn)生抗體的過程中均發(fā)揮重要作用，本研究通過觀察視黃酸受體基因在胸腺表達及其與兒童T淋巴細胞發(fā)育的關(guān)系，探討視黃酸對兒童T細胞的作用機制。 第一部分 視黃酸受體基因在兒童胸腺中的表達及意義 目的：胸腺是早期T淋巴細胞發(fā)育的重要場所，本研究旨在觀察視黃酸受體六種亞型基因在兒童胸腺的表達分布規(guī)律，探討其在兒童T細胞發(fā)育中的意義。 方法：采用地高辛素標記的反義RNA 探針原位雜交法，測定5歲以下兒童胸腺中視黃酸受體RARα、RARβ、RARγ， RXRα、RXRβ、RXRγ 六種亞型基因在mRNA水平的表達與分布；同期的連續(xù)冰凍切片還用免疫組織化學(xué)法測定CD1a、CD3的表達分布，分析視黃酸受體基因表達及分布與T淋巴細胞成熟的關(guān)系；并采用實時定量RT-PCR法對視黃酸受體基因在mRNA表達水平進行定量分析，了解視黃酸受體基因表達在兒童胸腺的變化規(guī)律。 結(jié)果：原位雜交結(jié)果顯示，胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)均表達RARα、RARγ mRNA, 其中RARα mRNA在胸腺皮質(zhì)區(qū)高表達；而RXRα、RXRβ mRNA主要在胸腺髓質(zhì)表達，尤其在哈氏小體外周的細胞表達較高；胸腺中未檢測到RARβ、RXRγ mRNA的表達。CD1a主要在胸腺皮質(zhì)表達，而CD3在胸腺髓質(zhì)表達，尤其在胸腺小體外周的胸腺細胞高表達。實時定量PCR分析結(jié)果顯示RARα、 RXRα mRNA在出生后第一年高表達，1歲后表達下降。RARγ mRNA則隨年齡增長表達增高，RXRβ mRNA在5歲以內(nèi)變化不明顯。 結(jié)論：視黃酸受體基因在胸腺中的表達隨兒童的發(fā)育而變化，并且其表達變化與T細胞的成熟有關(guān)，不同受體亞型基因表達水平的調(diào)節(jié)在T淋巴細胞的發(fā)育 WP=5 中可能具有重要意義。 第二部分 視黃酸受體α基因表達與兒童T淋巴細胞發(fā)育的研究 目的：外周T淋巴細胞對維持正常的免疫功能至關(guān)重要，胸腺提供了T淋巴細胞發(fā)育分化所需的微環(huán)境。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些核受體在T淋巴細胞的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，視黃酸受體也屬于核受體超家族，本研究通過對視黃酸受體α (RARα) 的活化或阻抑，研究其在兒童胸腺T淋巴細胞成熟分化中的作用及其機制。 方法：建立體外胸腺組織培養(yǎng)體系，在培養(yǎng)液中加入視黃酸受體活化劑-全反式視黃酸(atRA)或視黃酸受體拮抗劑-Ro41 5253。在培養(yǎng)的不同時間收集T細胞，用熒光標記的抗CD3、CD4、CD8抗體染色，，通過流式細胞儀分析，觀察T細胞成熟分化表面標志的變化。同時，從T細胞中抽提的RNA采用實時定量RT-PCR法檢測視黃酸受體α mRNA的表達。 結(jié)果：成功建立了體外胸腺組織培養(yǎng)體系，能夠支持T細胞的發(fā)育成熟。在生理濃度的全反式視黃酸(atRA)條件下，培養(yǎng)24小時能明顯促進未成熟的CD4+CD8+細胞向CD4+細胞分化，并且該作用可被RARα特異性拮抗劑Ro41 5253所拮抗。另一方面，atRA能抑制CD4+CD8+胸腺細胞向CD8+細胞分化，這種作用也在培養(yǎng)24小時出現(xiàn)。實時定量PCR結(jié)果顯示，atRA能促進RARα mRNA的表達，該作用可被Ro41 5253所拮抗。RT-PCR發(fā)現(xiàn)胸腺基質(zhì)細胞也表達RARα mRNA，實時定量PCR顯示其RARα mRNA的表達量較胸腺細胞低。胸腺基質(zhì)細胞在無atRA的情況下，RARα mRNA的表達無明顯變化；加入atRA后在體外培養(yǎng)24小時胸腺基質(zhì)細胞的RARα mRNA的表達開始升高，在48小時達高峰，與對照組相比差異有顯著性(P0.05)，Ro41 5253能拮抗這種作用。 結(jié)論：胸腺細胞與胸腺基質(zhì)細胞均表達視黃酸受體α基因，視黃酸受體α途徑的活化在促進CD4＋細胞的發(fā)育中起重要作用。 第三部分 Notch-1信號途徑在視黃酸影響T淋巴細胞發(fā)育中的作用 目的：Notch是一組跨膜受體，在多種器官及細胞的發(fā)育中起作用，主要決定細胞的分化方向。在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)四類Notch基因，編碼四種Notch受體，分別為Notch1～4。近年研究表明，Notchs受體的表達與活化在淋巴細胞的發(fā)育中起重要作用。在Notch受體家族中，Notch1與T淋巴細胞的發(fā)育密切相關(guān)。 視黃酸對人胸腺細胞Notch1基因的表達有無作用，以及視黃酸對胸腺細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)作用是否與Notch1途徑有關(guān)，尚未見報道。本研究通過檢測胸腺細胞發(fā) WP=6 育過程中Notch1 mRNA的表達變化，并觀察視黃酸對其表達的影響，初步探討Notch1信號途徑在視黃酸對T細胞分化發(fā)育中的作用。 方法：采用胸腺組織體外培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)中加入視黃酸受體活化劑-全反式視黃酸(atRA)或視黃酸受體拮抗劑-Ro41 5253。在培養(yǎng)的不同時間收集T細胞，用熒光標記的抗CD3、CD4、CD8抗體染色，?
【圖文】：

胸腺的結(jié)構(gòu)

19圖 1-2.胸腺髓質(zhì)(M)，HE 染色, 光鏡×200.含胸腺小體(HC)，周圍有上皮細胞( )，胸腺細胞( ) 。2. 兒童胸腺組織視黃酸受體 mRNA 的表達與分布我們對兒童胸腺組織采用原位雜交的方法，檢測了 RARá mmRNA、RAR mRNA、 RXRá mRNA、 RXRa mRNA、 RXR mR
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 任延利;齊德生;;維生素A在動物體內(nèi)的作用機理研究進展[J];中國飼料;2008年08期

本文編號：2645008