【摘要】：世界范圍內(nèi),宮頸癌是婦女第二高發(fā)腫瘤。持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是引發(fā)宮頸癌的主要原因。目前鑒定的高危型HPV有15型,其中HPV16,18是世界范圍內(nèi)的優(yōu)勢流行株,HPV58是東亞地區(qū)、中美和南美地區(qū)優(yōu)勢流行的病毒株。目前上市的以HPV主要蛋白L1為基礎(chǔ)的病毒樣顆粒(VLP)疫苗,主要誘發(fā)型別特異性中和抗體,僅可預(yù)防兩種高危型病毒(HPV16,18)感染及相關(guān)病變,對其他型別沒有交叉保護(hù)作用或交叉保護(hù)作用弱。目前缺乏HPV58LI VLPs誘發(fā)長期中和抗體的報(bào)道,且尚未見含HPV58L1VLPs的疫苗問世。次要蛋白L2存在保守交叉中和抗體表位,但其免疫原性很弱。由于HPV L1VLPs可直接活化DC細(xì)胞,且VLP表面的表位是高度規(guī)律性重復(fù)排列的,因此在VLP表面展示L2保守表位,獲得的嵌合病毒樣顆粒(cVLP)疫苗可望擴(kuò)展現(xiàn)有VLP疫苗的保護(hù)范圍。為了拓寬現(xiàn)有疫苗的保護(hù)范圍,本研究第一部分進(jìn)行含HPV58型的HPV16/18/58混合型VLP疫苗的研究,第二部分進(jìn)行了以HPV16LI VLPs為載體的嵌合L2表位疫苗的研究。 本研究在桿狀病毒昆蟲細(xì)胞中表達(dá)純化了HPV16,18,58L1VLPs,對各型VLPs進(jìn)行了純度、形態(tài)學(xué)及免疫原性的研究,特別是HPV58L1VLPs誘發(fā)長期中和抗體活性及協(xié)同Al(OH)3佐劑的相關(guān)研究,并比較了超離法與層析法純化HPV LI VLPs均一度及免疫原性的區(qū)別。在此基礎(chǔ)上,表達(dá)及純化了以HPV16L1VLPs為載體的嵌合各種HPV16L2保守表位的雜合蛋白,并對影響雜合L1組裝能力及其誘發(fā)中和抗體活性的因素進(jìn)行了研究。具體結(jié)果如下： 1.層析法純化獲得的人乳頭瘤病毒(HPV)16/18/58病毒樣顆粒疫苗的實(shí)驗(yàn)研究 1.1HPV16,18,58L1VLPs的純度、形態(tài)學(xué)及表位特征的分析 經(jīng)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色、ELISA及Western blot(后兩種方法分析Sf9宿主殘留蛋白)分析結(jié)果表明,層析法獲得的HPV16,18,58L1VLPs純度分別為99.5%,97.8%,98.4%。經(jīng)透射電鏡和動態(tài)光散射分析,HPV16,18,58L1蛋白都組裝成了與天然病毒類似的均一度很高的VLPs,直徑范圍分別為45-70nm,40-68nm,40-65nm。 ELISA結(jié)果表明HPV16L1VLPs保留了人群免疫優(yōu)勢的構(gòu)象依賴的中和抗體H16.V5識別的表位,HPV18,58L1VLPs分別保留了構(gòu)象依賴的中和抗體H18.J4, XM58-7識別的表位。以上結(jié)果表明在Sf9中表達(dá)純化的HPV L1VLPs純度很高,形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒類似,均一度高。 1.2層析法與超離法獲得HPV L1VLPs的比較 經(jīng)動態(tài)光散射分析,層析法獲得的HPV L1VLPs在水溶液中為單一的峰,而CsCl超離法獲得的VLPs為一個或多個峰。且超離法獲得的HPV L1VLPs水力學(xué)直徑比層析法的大,表明層析法獲得的HPV L1VLPs比較均一,超離法獲得的VLPs可能存在聚集。將超離法和層析法獲得的HPV16L1VLPs分別免疫小鼠,結(jié)果表明,層析法獲得的HPV16L1VLPs誘發(fā)的中和抗體比超離法的高,提示層析法純化獲得的HPV16L1VLPs具有很好的免疫原性。 1.3HPV16,18,58L1VLPs免疫原性及HPV58L1VLPs誘發(fā)長期中和抗體的分析 HPV L1VLPs免疫小鼠測定ED50,結(jié)果表明僅需分別免疫0.0275μg的HPV16L1VLPs,0.0172μg的HPV18L1VLPs,0.1140μg的HPV58L1VLPs就能使50%的小鼠陽轉(zhuǎn)。將HPV16,18,58L1VLPs單獨(dú)或混合免疫小鼠誘發(fā)了較高滴度的針對組成型別的中和抗體,且單價(jià)組與三價(jià)組誘發(fā)的中和抗體沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時,低劑量(0.1μg)的HPV58L1VLPs在單價(jià)組和三價(jià)組均誘發(fā)了長達(dá)48周的高滴度(103以上)的中和抗體。以上結(jié)果表明HPV16,18,58LI VLPs免疫原性很強(qiáng)。 1.4Al(OH)3佐劑及其劑量對HPV L1VLP疫苗活性的影響分析 取HPV16,18,58L1VLPs,分別采用低劑量(0.1μg)或高劑量(2μg)配制單價(jià)和三價(jià)疫苗,單獨(dú)或協(xié)同Al(OH)3佐劑免疫小鼠。血清中和抗體分析結(jié)果表明,僅在低劑量組,協(xié)同Al(OH)3佐劑能顯著增強(qiáng)單價(jià)和三價(jià)疫苗中HPV16,18L1VLPs免疫原性。但是不能顯著增強(qiáng)HPV58L1VLPs的免疫原性。 取HPV18L1VLPs與不同劑量的Al(OH)3佐劑(抗原：佐劑為1：6到1：1000)協(xié)同免疫小鼠,結(jié)果表明HPV18中和抗體的滴度隨著Al(OH)3佐劑劑量的增加增高。以上結(jié)果表明,Al(OH)3佐劑可增強(qiáng)HPV L1VLP疫苗的誘發(fā)中和抗體的水平,在一定范圍內(nèi),佐劑劑量越高,HPV L1VLPs誘發(fā)的中和抗體滴度越高。 2.人乳頭瘤病毒(HPV)16嵌合病毒樣顆粒疫苗的初步研究 2.1HPV16L1-L2重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與表達(dá)鑒定以HPV16L1基因?yàn)槟０?利用overlap PCR擴(kuò)增獲得在HPV16L1DE loop (aa.136/137)或H4C端(aa.430/433)插入單表位的HPV16L2aa.56-75(sE),分別命名為DE/sE,H4/sE,同理在這兩個位置插入兩個拷貝的HPV16L2aa.17-36(dE)的為DE/ddE, H4/ddE,在DE loop插入HPV16L2aa.17-36與aa.56-75串聯(lián)雙表位的為DE/sdEo將測序正確的HPV16L1-L2雜合基因裝載到pFastBac1載體,利用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系,在Sf9細(xì)胞中表達(dá)HPV16L1-L2雜合蛋白,并用層析法進(jìn)行了純化。 2.2HPV16L1-L2雜合蛋白純品的鑒定 電鏡分析結(jié)果表明H4/sE組裝成了VLPs且形態(tài)較規(guī)則。DE/ddE為五聚體,DE/sE, H4/ddE為VLPs和L1聚集物的混合體,DE/sdE為五聚體和L1聚集物的混合體。以本實(shí)驗(yàn)室制備的Sf9HCP兔多抗為一抗做Western blot,結(jié)果提示,DE/ddE, DE/sE, H4/sE的純度達(dá)到90%以上,DE/sdE純度為80%-90%。 2.3HPV16L1-L2雜合蛋白誘發(fā)HPV16中和抗體的分析 將HPV16L1-L2蛋白協(xié)同弗氏佐劑免疫小鼠,檢測結(jié)果表明,HPV16LI VLPs, H4/sE, DE/sE, H4/ddE, DE/ddE, DE/sdE誘發(fā)的骨架型別特異性的HPV16中和抗體滴度依次為3.2×104,1.8×104,2.7×103,1.2x102,5×101,50�？梢钥闯鯤4/sE, DE/sE誘發(fā)的HPV16中和抗體滴度比H4/ddE, DE/ddE的高,表明在DE loop和H4C端插入sE比插入ddE對骨架的影響小。無論在H4C端插入sE還是ddE,均比在DE loop插入相同的位點(diǎn)誘發(fā)的中和抗體滴度高。表明H4C端比DE loop更耐受外源表位的插入。 總之,本研究利用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),層析法純化獲得了純度高、形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒類似、免疫原性強(qiáng)的HPV16,18,58L1VLPs;低劑量HPV58L1VLPs在單價(jià)和三價(jià)疫苗中均可誘發(fā)持久高滴度的HPV58特異性中和抗體。本研究結(jié)果為含HPV58的多價(jià)VLP疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。有關(guān)HPV16L1不同表面區(qū)容納L2保守中和抗體表位的能力及其誘發(fā)中和抗體活性的研究將有利于廣譜HPV cVLPs的研究。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R737.33;R392
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本文編號：
2643630
