【摘要】：目的：觀測Wnt3a過表達(dá)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成軟骨能力的變化,以及Wnt3a影響B(tài)MSCs增殖、分化的相關(guān)機(jī)制。 方法：通過慢病毒在大鼠BMSCs中分別導(dǎo)入Wnt3a基因和Mock(陰性無功能基因片段)基因；使用熒光顯影及Western Blot對導(dǎo)入效果進(jìn)行鑒定。MTT法分析Wnt3a對BMSCs增殖的作用,進(jìn)而甲苯胺藍(lán)染色檢測基質(zhì)蛋白聚糖的生成情況,并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測軟骨分化標(biāo)志基因COL2A1、Aggrecan和SOX9的mRNA水平。通過觀測β-catenin、Ca2+磷酸化CaMKⅡ等蛋白與離子的變化判斷Wnt3a影響B(tài)MSCs軟骨分化的途徑,并使用DKK1和KN93分別抑制經(jīng)典及非經(jīng)典途徑,以分析各途徑在Wnt3a影響B(tài)MSCs增殖、分化過程中的作用。 結(jié)果：所有BMSCs經(jīng)慢病毒感染后用熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)；Western Blot發(fā)現(xiàn)Wnt3a轉(zhuǎn)染BMSCs后,其基因能夠表達(dá)。MTT分析顯示過表達(dá)Wnt3a的BMSCs增殖率顯著高于對照組(P0.05)；甲苯胺藍(lán)染色顯示BMSCs出Wnt3a的過表達(dá)降低了基質(zhì)蛋白聚糖的積累；Wnt3a表達(dá)上調(diào)同時(shí)導(dǎo)致COL2A1、Aggrecan和SOX9的mRNA水平顯著降低(P0.05)。Wnt3a的過表達(dá)造成了經(jīng)典途徑特異性標(biāo)志物β-catenin的上調(diào)；在過表達(dá)Wnt3a BMSCs的細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度升高(P0.05),并導(dǎo)致磷酸化CaMKⅡ濃度升高(P0.05),而對內(nèi)源性CaMKⅡ的表達(dá)無影響。用特異性抑制劑DKK1阻斷了經(jīng)典途徑后發(fā)現(xiàn),BMSCs的增殖回歸自然水平,但基質(zhì)蛋白聚糖進(jìn)一步減少,COL2A1、Aggrecan和SOX9的mRNA保持在低水平；用特異性抑制劑KN93阻斷了非經(jīng)典途徑后發(fā)現(xiàn),BMSCs的增殖能力不受其影響,而且基質(zhì)蛋白聚糖顯著增加,COL2A1、Aggrecan和SOX9mRNA的水平顯著上調(diào)(P0.05)。 結(jié)論：(1)Wnt3a增強(qiáng)了BMSCs的增殖。(2)Wnt3a抑制了BMSCs的成軟骨分化。(3) Wnt3a激活了MSC中的經(jīng)典途徑。(4) Wnt3a能夠激活非經(jīng)典的Ca2+/CaMKⅡ信號途徑。(5) Wnt3a可通過經(jīng)典Wnt途徑促進(jìn)BMSCs的增殖,但主要通過非經(jīng)典的Ca2+/CaMKⅡ途徑抑制BMSCs的成軟骨分化。(6)經(jīng)典途徑阻斷劑DKK1與Wnt3a在抑制BMSCs成軟骨分化的過程中發(fā)揮了協(xié)同作用。
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 呂昌偉,胡蘊(yùn)玉,白建萍,崔玉明;周期性流體應(yīng)力刺激對組織工程軟骨分化影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2003年09期

2 李瓊;張路;周廣東;曹誼林;;間充質(zhì)干細(xì)胞體外軟骨定向誘導(dǎo)條件的研究進(jìn)展[J];中國美容醫(yī)學(xué);2009年09期

3 王洋;張朝東;韓漫夫;任力杰;;堿性成纖維細(xì)胞生長因子及維生素C對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響[J];中國全科醫(yī)學(xué);2009年22期

4 張錦芳;謝偉東;張雅鷗;孔祥復(fù);;淫羊藿黃酮誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中WNT信號通路的研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年06期

5 鄭群;徐立紅;;經(jīng)典Wnt信號通路中β-連環(huán)蛋白的影響因素[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2009年02期

6 朱付平,熊光仲,王萬春,盧敏;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨科中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];中國中醫(yī)骨傷科雜志;2005年05期

7 王珍,徐根波;骨髓間質(zhì)干細(xì)胞及其臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];中國腫瘤;2005年11期

，

本文編號：2640100