【摘要】：近年來A型流感病毒(AIV)在中國(guó)的頻繁暴發(fā)給人們的生命健康帶來了嚴(yán)重威脅,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。高致病性流感病毒會(huì)導(dǎo)致感染動(dòng)物體內(nèi)炎性因子大量升高,由此認(rèn)為細(xì)胞因子風(fēng)暴是導(dǎo)致動(dòng)物死亡的主要原因。早期研究證明流感病毒可以在豚鼠體內(nèi)感染復(fù)制,本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)病毒感染并不能導(dǎo)致豚鼠機(jī)體產(chǎn)生“高細(xì)胞因子風(fēng)暴”,且豚鼠可以在感染后5～7天清除流感病毒,這為我們研究宿主利用先天性免疫應(yīng)答機(jī)制清除流感病毒提供了十分理想的動(dòng)物模型。本課題共分為兩大部分,第一部分主要是利用豚鼠作為模式動(dòng)物,豚鼠細(xì)胞系作為模式細(xì)胞,利用H5N1禽流感病毒作為模式病毒研究宿主抵抗流感病毒的先天性免疫決定因子。主要利用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)合轉(zhuǎn)錄水平分析對(duì)AIV感染的豚鼠肺臟組織和肺成纖維細(xì)胞系進(jìn)行表達(dá)譜分析。在此基礎(chǔ)上,對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行抗AIV功能的探索,篩選到了抑制流感病毒復(fù)制和下調(diào)細(xì)胞因子的關(guān)鍵蛋白,明確了豚鼠抗炎性反應(yīng)的關(guān)鍵通路。論文第二部分為了探索低致病H9N2禽流感病毒對(duì)人類的致病性,利用恒河猴作為動(dòng)物模型進(jìn)行了H9N2流感病毒致病力分析。具體介紹如下： 第一部分： 通過對(duì)豚鼠肺臟組織和肺臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)譜變化分析,結(jié)果表明無(wú)論從體內(nèi)水平(豚鼠肺臟)還是體外水平(豚鼠肺成纖維細(xì)胞),豚鼠感染H5N1AIV后都沒有高細(xì)胞因子的發(fā)生。感染豚鼠24小時(shí)后引發(fā)肺臟65個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),135個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。感染72小時(shí)后引發(fā)肺臟24個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),39個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。AIV感染肺臟成纖維細(xì)胞12小時(shí)后引發(fā)61個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),71個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。感染24小時(shí)后引發(fā)51個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),30個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。AIV感染后導(dǎo)致豚鼠肺臟和肺成纖維細(xì)胞中免疫應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化,這些基因參與IFN途徑、細(xì)胞凋亡以及補(bǔ)體激活等。這些H5N1AIV感染變化基因可能具有抗病毒作用,也可能具有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的作用。 利用過表達(dá)技術(shù)和RNAi技術(shù),在體外過表達(dá)RIG-I、MVAS、SPA、SPD、GBP-1、 Mx-1、HSP70和HSP90,同時(shí)對(duì)GBP-1進(jìn)行RNAi體外抑制該基因表達(dá),探索上述基因的抗AIV活性。結(jié)果表明過表達(dá)RIG-I和MAVS可明顯抑制流感病毒在豚鼠細(xì)胞中的復(fù)制,Mx-1也具有抑制作用,但效果不如RIG-I和MAVS明顯。GBP-1細(xì)胞水平過表達(dá)可以下調(diào)流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子,其在協(xié)同RIG-I發(fā)揮抗AIV作用中發(fā)揮重要作用。 通過研究AIV感染后豚鼠體內(nèi)補(bǔ)體變化情況發(fā)現(xiàn),豚鼠感染AIV后會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)補(bǔ)體C3表達(dá)量升高。通過藥物拮抗豚鼠體內(nèi)補(bǔ)體后其抗流感病毒能力明顯減弱,同時(shí)伴隨著抑制體內(nèi)細(xì)胞凋亡,顯著上調(diào)趨化因子IP10的表達(dá)量,表明補(bǔ)體可能通過調(diào)控體內(nèi)細(xì)胞凋亡進(jìn)而可以發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的作用。 第二部分： 利用非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物——恒河猴作為模式動(dòng)物進(jìn)行了H9N2AIV致病性研究,結(jié)果表明感染后恒河猴出現(xiàn)雙向熱和病毒性肺炎,可以從感染猴的鼻洗液和咽拭子中分離出流感病毒,排毒期持續(xù)7～9天,組織嗜性和免疫組化結(jié)果表明H9N2AIV可以在上呼吸道(鼻甲骨、氣管和支氣管)和所有的肺葉中復(fù)制。通過本次研究表明恒河猴是一種研究H9N2AIV進(jìn)化和致病力的較為理想的動(dòng)物模型。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2639843