【摘要】：近年來A型流感病毒(AIV)在中國的頻繁暴發(fā)給人們的生命健康帶來了嚴(yán)重威脅,造成了巨大的經(jīng)濟損失。高致病性流感病毒會導(dǎo)致感染動物體內(nèi)炎性因子大量升高,由此認(rèn)為細胞因子風(fēng)暴是導(dǎo)致動物死亡的主要原因。早期研究證明流感病毒可以在豚鼠體內(nèi)感染復(fù)制,本研究進一步發(fā)現(xiàn)病毒感染并不能導(dǎo)致豚鼠機體產(chǎn)生“高細胞因子風(fēng)暴”,且豚鼠可以在感染后5～7天清除流感病毒,這為我們研究宿主利用先天性免疫應(yīng)答機制清除流感病毒提供了十分理想的動物模型。本課題共分為兩大部分,第一部分主要是利用豚鼠作為模式動物,豚鼠細胞系作為模式細胞,利用H5N1禽流感病毒作為模式病毒研究宿主抵抗流感病毒的先天性免疫決定因子。主要利用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)合轉(zhuǎn)錄水平分析對AIV感染的豚鼠肺臟組織和肺成纖維細胞系進行表達譜分析。在此基礎(chǔ)上,對差異表達蛋白進行抗AIV功能的探索,篩選到了抑制流感病毒復(fù)制和下調(diào)細胞因子的關(guān)鍵蛋白,明確了豚鼠抗炎性反應(yīng)的關(guān)鍵通路。論文第二部分為了探索低致病H9N2禽流感病毒對人類的致病性,利用恒河猴作為動物模型進行了H9N2流感病毒致病力分析。具體介紹如下： 第一部分： 通過對豚鼠肺臟組織和肺臟成纖維細胞轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達譜變化分析,結(jié)果表明無論從體內(nèi)水平(豚鼠肺臟)還是體外水平(豚鼠肺成纖維細胞),豚鼠感染H5N1AIV后都沒有高細胞因子的發(fā)生。感染豚鼠24小時后引發(fā)肺臟65個蛋白表達上調(diào),135個蛋白表達下調(diào)。感染72小時后引發(fā)肺臟24個蛋白表達上調(diào),39個蛋白表達下調(diào)。AIV感染肺臟成纖維細胞12小時后引發(fā)61個蛋白表達上調(diào),71個蛋白表達下調(diào)。感染24小時后引發(fā)51個蛋白表達上調(diào),30個蛋白表達下調(diào)。AIV感染后導(dǎo)致豚鼠肺臟和肺成纖維細胞中免疫應(yīng)答相關(guān)基因表達發(fā)生變化,這些基因參與IFN途徑、細胞凋亡以及補體激活等。這些H5N1AIV感染變化基因可能具有抗病毒作用,也可能具有調(diào)節(jié)細胞因子的作用。 利用過表達技術(shù)和RNAi技術(shù),在體外過表達RIG-I、MVAS、SPA、SPD、GBP-1、 Mx-1、HSP70和HSP90,同時對GBP-1進行RNAi體外抑制該基因表達,探索上述基因的抗AIV活性。結(jié)果表明過表達RIG-I和MAVS可明顯抑制流感病毒在豚鼠細胞中的復(fù)制,Mx-1也具有抑制作用,但效果不如RIG-I和MAVS明顯。GBP-1細胞水平過表達可以下調(diào)流感病毒誘導(dǎo)的細胞因子,其在協(xié)同RIG-I發(fā)揮抗AIV作用中發(fā)揮重要作用。 通過研究AIV感染后豚鼠體內(nèi)補體變化情況發(fā)現(xiàn),豚鼠感染AIV后會導(dǎo)致體內(nèi)補體C3表達量升高。通過藥物拮抗豚鼠體內(nèi)補體后其抗流感病毒能力明顯減弱,同時伴隨著抑制體內(nèi)細胞凋亡,顯著上調(diào)趨化因子IP10的表達量,表明補體可能通過調(diào)控體內(nèi)細胞凋亡進而可以發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞因子的作用。 第二部分： 利用非人類靈長類動物——恒河猴作為模式動物進行了H9N2AIV致病性研究,結(jié)果表明感染后恒河猴出現(xiàn)雙向熱和病毒性肺炎,可以從感染猴的鼻洗液和咽拭子中分離出流感病毒,排毒期持續(xù)7～9天,組織嗜性和免疫組化結(jié)果表明H9N2AIV可以在上呼吸道(鼻甲骨、氣管和支氣管)和所有的肺葉中復(fù)制。通過本次研究表明恒河猴是一種研究H9N2AIV進化和致病力的較為理想的動物模型。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

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本文編號：2639843