【摘要】： 傳統的抗生素是由霉菌或放線菌產生的，霉菌或放線菌是人類尋找抗生素的傳統領域。肽抗生素(peptide antibiotics)或稱為抗微生物肽(antimicrobial peptide)則是近年來發(fā)現的由動物、植物、昆蟲等生物體基因編碼的具有抗生素樣活性的肽類物質。它是機體免疫系統的重要組成部分，因其在作為抗感染制劑、食品防腐劑等方面具有廣闊的應用前景而成為近年來國內外研究的熱點之一。 迄今已從動物、植物、昆蟲等生物體內分離到肽抗生素300多種，新的肽抗生素還在不斷被發(fā)現，有的類別還發(fā)現存在多種突變體。不同種類、不同突變體的肽抗生素活性有不同程度差異。為了獲得結構簡單、活性更強的肽抗生素，研究者們常常在克隆到肽抗生素分子后，通過構建其突變體庫，從中篩選更理想的目的分子。這種篩選工作量大、盲目性強、成本高，目前在高活性肽抗生素分子的設計方面可借鑒的數據也不多。 基于以上認識，我們進行了：①人源肽抗生素hPAB-β的基因克隆，成熟肽的化學合成及活性初步鑒定。②hPAB-β重組桿狀病毒的構建及原核高效、穩(wěn)定表達工程菌的建立。③hPAB-β突變體的設計及其高效表達工程菌的構建。④融合蛋白的純化、目的蛋白分離及復性、抗菌活性測定及突變體篩選。其實驗內容和實驗結果主要包括以下幾個方面： 1．人源肽抗生素hPAB-β的基因克�。孩賹游�23種β型肽抗生素的氨基酸序列進行對比，選擇部分相似性較高的序列，分析其成熟肽的結構特點，抽提β型肽抗生素的一級結構特征，并以此為基礎設計簡并引物。②應用SMART PCR試劑盒和簡并引物從人皮膚角質形成細胞cDNA中擴增到 長分別為24obp和1 3obp左右的2種片段，將它們插入pMD 18一T載體，用 酶切法初步篩選陽性重組子pM.hRABL和pM一hRABS，對陽性重組子進一 步作測序鑒定。③對測序獲得的DNA序列進行ORF分析，發(fā)現2個大于 100bp的ORF，一個192bp，另一個147bp，第二個ORF與第一個的3’一端完全 重疊，可能為假基因。真正的基因可能為第一個O即。經BLASTn檢索， 在GenBank中發(fā)現第一個ORF與動物p一膚抗生素高度相似，與人膚抗生 素hBD一1、hBD一2、hBD一3分別有4 1 .14%、76.56%、55.21%的堿基相同，， 在氨基酸水平分別有36.51%、79.37%、46.03%相同。結果表明克隆到的基 因極可能是人p一型膚抗生素家族中的一個新成員，將之命名為hPAB一p (human peptide antibioties一p)。④新克隆的hPAB一p編碼63個氨基酸，經 信號膚分析表明hPAB一p編碼一22個氨基酸組成的信號膚，成熟膚為41 個氨基酸，分子量4333.04Da，等電點(px)8.791。 2.hPAB一p抗菌活性初步鑒定:①采用固相法合成了hPAB一p成熟膚， 經即一HPLC純化后用質譜測定合成膚的分子量為4334.%Da，與其理論分 子量相符。②采用谷膚甘膚氧化/還原法對合成膚進行復性，平板法測得復 性后合成膚對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等實驗菌均具 有殺菌活性。 3.突變體的設計及其重組桿狀病毒構建:①采用同源模建法分析 hPAB一p的空間結構，并以此結構為基礎，設計hPAB一p突變體hPAB一p 38和hPAB一p 34。②通過引物設計引入突變和PCR擴增法獲得突變體的 基因序列，并將之插入桿狀病毒供體質粒pFAST HTa中，篩選重組質粒進 一步轉染攜帶桿狀病毒的DH 1 OBac大腸埃希菌。遺憾的是本研究在用重組 桿狀病毒DNA轉染昆蟲Sf-9細胞時未獲得重組病毒。 4.h隊B一p及其突變體高效表達工程菌的構建:①將用PCR擴增的 h隊B一p、h獄B一p 35、h隊B一p 34基因，分別與pinpointXa一3質粒連接， 轉化JM 109大腸埃希菌，獲得的工程菌在表達融合蛋白時不穩(wěn)定，第5代 后即見不到表達條帶。②將pinpoini一hPAB-p重組質粒轉化入蛋白酶缺陷 BLZI大腸埃希菌，新篩選到的菌株表達的融合蛋白占細菌總蛋白的20% 左右，但在傳至n代后也見不到融合蛋白表達，工程菌逐步喪失融合蛋白 表達能力的原因不詳，可能與融合蛋白中的承載蛋白分子(Carrier protein， CP)不夠理想有關。③根據膚抗生素的特性要求，特異設計并篩選到了 個新的承載分子，將膚抗生素hPAB一日及其突變體hPAB一p 38、h隊B一p34 分別插入該承載分子3’端構建成融合基因，在兩個基因間含有澳化氰 (cNBr)的裂解位點，進一步將融合基因插入pQE一32表達載體，轉化大 腸埃希菌篩選出pQE一h隊B一p/J M 1 09工程菌，經表達分析，該工程菌表達 穩(wěn)定，表達的融合蛋白占細菌總蛋白的40%以上，為膚抗生素hPAB一目及 其突變體的制備、純化和篩選奠定了基礎。 5.重組膚抗生素的純化及活性測定:①大量表達并分離膚抗生素h隊B- 日及其突變體融合蛋白包涵體，采用smol/L尿素或6mol幾鹽酸肌溶解包涵 體并用Ni一Nl’A柱純化融合蛋白。②用CNBr裂解融合蛋白，經透析后用葡 聚糖凝膠過濾和陽離子交換層析分離和純化目的膚抗生素。③采用谷膚甘膚 氧化/還原法對重組膚抗生素進行復性，應用平板法和稀釋法測定復性目的 產物對8株實驗室保存菌株及10個臨床分離株的殺菌活性，表明重組膚抗 生素hPAB一p和突變體hPAB一日38與化學合成的hPAB一p有
【圖文】：

38重組Baemid.)四、重組桿狀病毒DNA轉染Sf一9昆蟲細胞培養(yǎng)的正常Sf-9昆蟲細胞見圖3一11，細胞大小較均勻，折光性好。應用脂質體法轉染了重組桿狀病毒DNA48h后，見有的細胞變大，體積可達正常細胞的3一4倍，同時可見有的細胞死亡(圖3一12)。在轉染%h后收獲培養(yǎng)上清，用少量該培養(yǎng)上清接種新培養(yǎng)并長成70%左右單層的Sf-9昆蟲細胞進行病毒擴增，結果在3天后細胞形態(tài)仍然正常，見不到變大、死亡等形態(tài)學改變。表明轉染未獲得重組病毒。換用脂質體TOPO以及用電穿孔法進行多次轉染，結果均未獲成功。

加入IPTG至終濃度為500卜mol/L，37℃誘導表達sh，取適量的表達菌行SDS一PAGE電泳，結果如圖4一3所示，從圖中可見2、3、5、7號陽性重組子在約17kDa處有一條蛋白帶，此蛋白與推測的融合蛋白分子量大小相符，可能為序列正確的陽性重組子表達產物;而6、10、n號則在約24kDa處有蛋白表達，推測與堿基，準已甲"12345678910圖4一3融合蛋白在JM109大腸埃希菌中的表達Fig.4一3SDS一PAGEanalysisofhPAB一pfusionProteinsexPressedinE.coliJM109(l:E.eoliJMlog:2:PinPointXa一3/JMlogindueedbyIPTG:3:lowmoleeularweightProteinmarker(97.4，66.7，43，31，20.2
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：Q78

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 劉繼梅,陳善娜,楊明摯,鄢波,黃興奇;簡并引物在PCR擴增甘油-3-磷酸轉酰酶基因中的應用[J];云南植物研究;1998年02期

2 杜占文,張俊武;應用簡并引物RT-PCR擴增鋅指結構域篩選新基因[J];中國醫(yī)學科學院學報;2001年03期

本文編號：2639648