【摘要】： 傳統(tǒng)的抗生素是由霉菌或放線菌產(chǎn)生的，霉菌或放線菌是人類尋找抗生素的傳統(tǒng)領(lǐng)域。肽抗生素(peptide antibiotics)或稱為抗微生物肽(antimicrobial peptide)則是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的由動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)等生物體基因編碼的具有抗生素樣活性的肽類物質(zhì)。它是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，因其在作為抗感染制劑、食品防腐劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景而成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。 迄今已從動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)等生物體內(nèi)分離到肽抗生素300多種，新的肽抗生素還在不斷被發(fā)現(xiàn)，有的類別還發(fā)現(xiàn)存在多種突變體。不同種類、不同突變體的肽抗生素活性有不同程度差異。為了獲得結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、活性更強(qiáng)的肽抗生素，研究者們常常在克隆到肽抗生素分子后，通過(guò)構(gòu)建其突變體庫(kù)，從中篩選更理想的目的分子。這種篩選工作量大、盲目性強(qiáng)、成本高，目前在高活性肽抗生素分子的設(shè)計(jì)方面可借鑒的數(shù)據(jù)也不多。 基于以上認(rèn)識(shí)，我們進(jìn)行了：①人源肽抗生素hPAB-β的基因克隆，成熟肽的化學(xué)合成及活性初步鑒定。②hPAB-β重組桿狀病毒的構(gòu)建及原核高效、穩(wěn)定表達(dá)工程菌的建立。③hPAB-β突變體的設(shè)計(jì)及其高效表達(dá)工程菌的構(gòu)建。④融合蛋白的純化、目的蛋白分離及復(fù)性、抗菌活性測(cè)定及突變體篩選。其實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1．人源肽抗生素hPAB-β的基因克�。孩賹�(duì)動(dòng)物23種β型肽抗生素的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，選擇部分相似性較高的序列，分析其成熟肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，抽提β型肽抗生素的一級(jí)結(jié)構(gòu)特征，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。②應(yīng)用SMART PCR試劑盒和簡(jiǎn)并引物從人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增到 長(zhǎng)分別為24obp和1 3obp左右的2種片段，將它們插入pMD 18一T載體，用 酶切法初步篩選陽(yáng)性重組子pM.hRABL和pM一hRABS，對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)一 步作測(cè)序鑒定。③對(duì)測(cè)序獲得的DNA序列進(jìn)行ORF分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)大于 100bp的ORF，一個(gè)192bp，另一個(gè)147bp，第二個(gè)ORF與第一個(gè)的3’一端完全 重疊，可能為假基因。真正的基因可能為第一個(gè)O即。經(jīng)BLASTn檢索， 在GenBank中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)ORF與動(dòng)物p一膚抗生素高度相似，與人膚抗生 素hBD一1、hBD一2、hBD一3分別有4 1 .14%、76.56%、55.21%的堿基相同，， 在氨基酸水平分別有36.51%、79.37%、46.03%相同。結(jié)果表明克隆到的基 因極可能是人p一型膚抗生素家族中的一個(gè)新成員，將之命名為hPAB一p (human peptide antibioties一p)。④新克隆的hPAB一p編碼63個(gè)氨基酸，經(jīng) 信號(hào)膚分析表明hPAB一p編碼一22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)膚，成熟膚為41 個(gè)氨基酸，分子量4333.04Da，等電點(diǎn)(px)8.791。 2.hPAB一p抗菌活性初步鑒定:①采用固相法合成了hPAB一p成熟膚， 經(jīng)即一HPLC純化后用質(zhì)譜測(cè)定合成膚的分子量為4334.%Da，與其理論分 子量相符。②采用谷膚甘膚氧化/還原法對(duì)合成膚進(jìn)行復(fù)性，平板法測(cè)得復(fù) 性后合成膚對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等實(shí)驗(yàn)菌均具 有殺菌活性。 3.突變體的設(shè)計(jì)及其重組桿狀病毒構(gòu)建:①采用同源模建法分析 hPAB一p的空間結(jié)構(gòu)，并以此結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)hPAB一p突變體hPAB一p 38和hPAB一p 34。②通過(guò)引物設(shè)計(jì)引入突變和PCR擴(kuò)增法獲得突變體的 基因序列，并將之插入桿狀病毒供體質(zhì)粒pFAST HTa中，篩選重組質(zhì)粒進(jìn) 一步轉(zhuǎn)染攜帶桿狀病毒的DH 1 OBac大腸埃希菌。遺憾的是本研究在用重組 桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)Sf-9細(xì)胞時(shí)未獲得重組病毒。 4.h隊(duì)B一p及其突變體高效表達(dá)工程菌的構(gòu)建:①將用PCR擴(kuò)增的 h隊(duì)B一p、h獄B一p 35、h隊(duì)B一p 34基因，分別與pinpointXa一3質(zhì)粒連接， 轉(zhuǎn)化JM 109大腸埃希菌，獲得的工程菌在表達(dá)融合蛋白時(shí)不穩(wěn)定，第5代 后即見(jiàn)不到表達(dá)條帶。②將pinpoini一hPAB-p重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入蛋白酶缺陷 BLZI大腸埃希菌，新篩選到的菌株表達(dá)的融合蛋白占細(xì)菌總蛋白的20% 左右，但在傳至n代后也見(jiàn)不到融合蛋白表達(dá)，工程菌逐步喪失融合蛋白 表達(dá)能力的原因不詳，可能與融合蛋白中的承載蛋白分子(Carrier protein， CP)不夠理想有關(guān)。③根據(jù)膚抗生素的特性要求，特異設(shè)計(jì)并篩選到了 個(gè)新的承載分子，將膚抗生素hPAB一日及其突變體hPAB一p 38、h隊(duì)B一p34 分別插入該承載分子3’端構(gòu)建成融合基因，在兩個(gè)基因間含有澳化氰 (cNBr)的裂解位點(diǎn)，進(jìn)一步將融合基因插入pQE一32表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大 腸埃希菌篩選出pQE一h隊(duì)B一p/J M 1 09工程菌，經(jīng)表達(dá)分析，該工程菌表達(dá) 穩(wěn)定，表達(dá)的融合蛋白占細(xì)菌總蛋白的40%以上，為膚抗生素hPAB一目及 其突變體的制備、純化和篩選奠定了基礎(chǔ)。 5.重組膚抗生素的純化及活性測(cè)定:①大量表達(dá)并分離膚抗生素h隊(duì)B- 日及其突變體融合蛋白包涵體，采用smol/L尿素或6mol幾鹽酸肌溶解包涵 體并用Ni一Nl’A柱純化融合蛋白。②用CNBr裂解融合蛋白，經(jīng)透析后用葡 聚糖凝膠過(guò)濾和陽(yáng)離子交換層析分離和純化目的膚抗生素。③采用谷膚甘膚 氧化/還原法對(duì)重組膚抗生素進(jìn)行復(fù)性，應(yīng)用平板法和稀釋法測(cè)定復(fù)性目的 產(chǎn)物對(duì)8株實(shí)驗(yàn)室保存菌株及10個(gè)臨床分離株的殺菌活性，表明重組膚抗 生素hPAB一p和突變體hPAB一日38與化學(xué)合成的hPAB一p有
【圖文】：

38重組Baemid.)四、重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf一9昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)的正常Sf-9昆蟲(chóng)細(xì)胞見(jiàn)圖3一11，細(xì)胞大小較均勻，折光性好。應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染了重組桿狀病毒DNA48h后，見(jiàn)有的細(xì)胞變大，體積可達(dá)正常細(xì)胞的3一4倍，同時(shí)可見(jiàn)有的細(xì)胞死亡(圖3一12)。在轉(zhuǎn)染%h后收獲培養(yǎng)上清，用少量該培養(yǎng)上清接種新培養(yǎng)并長(zhǎng)成70%左右單層的Sf-9昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，結(jié)果在3天后細(xì)胞形態(tài)仍然正常，見(jiàn)不到變大、死亡等形態(tài)學(xué)改變。表明轉(zhuǎn)染未獲得重組病毒。換用脂質(zhì)體TOPO以及用電穿孔法進(jìn)行多次轉(zhuǎn)染，結(jié)果均未獲成功。

加入IPTG至終濃度為500卜mol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)sh，取適量的表達(dá)菌行SDS一PAGE電泳，結(jié)果如圖4一3所示，從圖中可見(jiàn)2、3、5、7號(hào)陽(yáng)性重組子在約17kDa處有一條蛋白帶，此蛋白與推測(cè)的融合蛋白分子量大小相符，可能為序列正確的陽(yáng)性重組子表達(dá)產(chǎn)物;而6、10、n號(hào)則在約24kDa處有蛋白表達(dá)，推測(cè)與堿基，準(zhǔn)已甲"12345678910圖4一3融合蛋白在JM109大腸埃希菌中的表達(dá)Fig.4一3SDS一PAGEanalysisofhPAB一pfusionProteinsexPressedinE.coliJM109(l:E.eoliJMlog:2:PinPointXa一3/JMlogindueedbyIPTG:3:lowmoleeularweightProteinmarker(97.4，66.7，43，31，20.2
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉繼梅,陳善娜,楊明摯,鄢波,黃興奇;簡(jiǎn)并引物在PCR擴(kuò)增甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)酰酶基因中的應(yīng)用[J];云南植物研究;1998年02期

2 杜占文,張俊武;應(yīng)用簡(jiǎn)并引物RT-PCR擴(kuò)增鋅指結(jié)構(gòu)域篩選新基因[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2001年03期

本文編號(hào)：2639648