【摘要】：乙型肝炎病毒(HBV)感染致肝細(xì)胞損傷的機制，與病毒蛋白和肝細(xì)胞蛋白間的相互作用密切相關(guān)。而乙型肝炎e抗原(HBeAg)是由HBV DNA前-C基因區(qū)編碼的一種非顆粒性的分泌蛋白，隨HBV復(fù)制而增加，臨床上將其作為判斷HBV活動性復(fù)制的指標(biāo)之一。因此研究HBeAg與肝細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用及其機理，能在一定程度上對HBV的致病機制做出解釋，并為尋找有效防治方法提供新線索。 酵母雙雜交技術(shù)是一種研究蛋白-蛋白間相互作用的比較快速、可靠并可大規(guī)模篩選的方法。本實驗所采用酵母雙雜交系統(tǒng)-3，基于兩種單倍體酵母a和α型可以配合形成二倍體，而其中表達(dá)的外源蛋白仍能相互作用的機理，免去了低效率文庫質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的問題，大大提高了雜交效率；在原技術(shù)基礎(chǔ)上增加了3個報告基因，降低了假陽性率。我們利用該技術(shù)，根據(jù)中國HBV流行株序列設(shè)計引物，，應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，由乙型肝炎患者血清中分離出HBeAg編碼基因序列。經(jīng)測序鑒定正確后，克隆入酵母表達(dá)載體pGBKT7中構(gòu)建“誘餌”質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109(a型)，表達(dá)后通過Western-blotting鑒定產(chǎn)物活性。隨后與預(yù)轉(zhuǎn)了人肝cDNA文庫質(zhì)粒pACT2的酵母細(xì)胞Y187(α型)進行配合，經(jīng)營養(yǎng)缺陷和藍(lán)白斑雙重篩選，獲得了HBeAg結(jié)合蛋白陽性克隆245株。提取陽性克隆酵母質(zhì)粒，通過Cacl_2穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，接種于氨芐青霉素-LB平板，篩選陽性克隆并進行序列測定。測序結(jié)果在GenBank中進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)未知功能的新基因有6條，已知蛋白基因35條。 博士論文--一摘要 為進一步確證經(jīng)酵母雙雜交技術(shù)篩選出的結(jié)合蛋白與HBeAg在體外也存在 相互作用，我們根據(jù)Genbank中提供的序列信息設(shè)計引物，以HePGZ細(xì)胞的 mRNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄一PCR擴增出CD81及新基因AK026018的全序列，測 序鑒定后，經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化后，克隆入酵母表達(dá)載體pGADT7，在TNT 網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中進行體外翻譯，摻入同位素3，s，與HBeAg進行體外免疫共 沉淀反應(yīng)，經(jīng)SDS一PAGE電泳，一20℃條件下放射自顯影，再次證實上述蛋白間 結(jié)合作用的可靠性。 在新基因功能的研究方面，我們對HBeAg結(jié)合蛋白新基因AKO26018進行了 初步探討。首先明確了該基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，主要位于細(xì)胞漿中;通過 其對HePGZ細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片的研究，推測該基因可能在細(xì)胞中起著多種復(fù)雜 作用，可通過多種途徑對許多類型基因表達(dá)進行調(diào)控或影響。通過過表達(dá)及SIRNA 抑制實驗證實，在LZ .2.15細(xì)胞株中HBeAg的分泌量與細(xì)胞內(nèi)AK026018 mRNA 的含量正相關(guān)。同時CD81過表達(dá)實驗證實，隨著cD81 mRNA量的增加HBeAg 的分泌量反而降低。因此推測AKo26018基因及cD81對HBeAg的分泌分別有促 進及阻礙作用。
【圖文】：

HAg00marks;1:陽性結(jié)果;2:陰性結(jié)果;3:空白的鑒定結(jié)果:經(jīng)雙酶切后電泳鑒定(結(jié)果見圖1.3)，可見與插入片的質(zhì)粒片段，將此重組質(zhì)粒命名為T-eAg。利用T7通公布中國HBV基因型流行株序列比較核酸及氨基酸88%一100%，同時存在移碼及缺失突變。選取一株%%及100%，且OR衛(wèi)正確的重組T-eAg質(zhì)粒繼續(xù)進

1:空質(zhì)粒對照;2:陰性克隆;3:陽性克隆3，3重組結(jié)合域載體鑒定結(jié)果:重組結(jié)合域載體經(jīng)雙酶切后電泳鑒定(結(jié)果見圖1.4)，可見與插入片段大小一致的片段及酶切后的質(zhì)粒片段，將此重組質(zhì)粒命名為pGBKT7一eAg。圖1.4重組質(zhì)粒pGBKT7一eAg的酶切鑒定MI:LalllbdaDN戶口EeoRl+Hind111marks;MZ:DL一2000marks;1，2:陽性克隆;3:陰性克隆3.4酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化鑒定結(jié)果:上述重組結(jié)合域載體pGBKT7一eAg用乙酸鏗轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞AHI的培養(yǎng)，酚一氯仿一異戊醇抽提，純化DNA，應(yīng)用PCR方法進行擴增，可見與預(yù)期大小一致的片段證明轉(zhuǎn)化成功。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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