【摘要】：本研究建立了網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增（ramification amplification method, RAM）技術(shù)檢測EB病毒基因的新方法。并應(yīng)用該方法檢測了非霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌患者外周血中EB病毒基因。 網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增法是利用環(huán)形探針，在PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行的基因擴(kuò)增方法。環(huán)形探針是一種設(shè)計(jì)獨(dú)特的核酸探針，它包括三個(gè)區(qū)域：5’和3’端與靶核酸互補(bǔ)序列和位于5’和3’端之間的基因連接區(qū)，一旦環(huán)形探針與靶基因雜交，它的5’端和3’端在DNA連接酶的作用下環(huán)形探針閉合成環(huán)形，呈螺旋狀纏繞在靶基因上，然后，延著環(huán)形探針，DNA聚合酶延伸連接的正向引物，置換下游鏈，產(chǎn)生多聚ssDNA，以多聚ssDNA作為模板，反向引物與它雜交、延長、置換下游鏈，產(chǎn)生大的分枝DNA復(fù)合物，使RAM產(chǎn)物呈指數(shù)級擴(kuò)增。 方 法： RAM方法：將待檢的細(xì)胞溶于5M GTC溶液中，60℃ 1h，37℃過夜（使蛋白變性，核酸酶失活，雙鏈DNA結(jié)構(gòu)疏松），將待檢標(biāo)本（或靶基因）與環(huán)形探針、捕獲探針及雜交緩沖液充分混勻，55℃條件水浴1h，加入磁珠，通過捕獲探針上結(jié)合的生物素與磁珠表面的鏈霉素抗生物素蛋白結(jié)合，通過磁性分離捕獲探針-靶基因-環(huán)形探針復(fù)合物，用TE緩沖液洗滌磁珠，去除未雜交的探針和細(xì)胞成分，加入Taq DNA連接酶，60℃ 20min，，使環(huán)形探針的5，和3，端對合形成環(huán)形，固定在靶基因上，加入RAM引物、Bst DNA多聚酶、dNTP、T4基因蛋白、DMSO、雜交緩沖液，63℃ 1h，然 WP=98 后95℃加熱滅活Bst DNA多聚酶，取RAM擴(kuò)增產(chǎn)物加入EcoR I酶切，37℃過夜，2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。 RAM方法敏感性實(shí)驗(yàn)：用人工合成的EBER-1的特異性序列分別作不同濃度（108 107 106 105 104 103 102 101）稀釋，以此作為靶基因用以檢測RAM方法的敏感性。 PCR檢測法：反應(yīng)體系為50ul，反應(yīng)混合物含5ul10×PCR緩沖液、300μMdNTP、0.6pmolPCR上、下游引物，2u Tag DNA聚合酶、和0.1μg樣品DNA，反應(yīng)條件為94℃5min，94℃ 1min、54℃ 1min、72℃ 1min共35輪循環(huán)，末次循環(huán)后72℃ 5min，2%的瓊脂糖凝膠電泳。 原位雜交法：取制備好的細(xì)胞涂片，以生物素標(biāo)記的探針（RAM法的捕獲探針相同）檢測細(xì)胞中的EBER-1基因。按試劑盒說明書操作（購于鼎國生物工程有限公司）。 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用田口玄一的積累方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié) 果： 1.RAM的敏感度高、特異性強(qiáng)、方法簡便易行、不需特殊設(shè)備，更適用于在基層醫(yī)療單位推廣應(yīng)用。 RAM具有高度的敏感性：RAM擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)方式擴(kuò)增的，可將極微量的DNA擴(kuò)增到紫外光可見的水平，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)RAM最少能夠檢出10個(gè)分子的靶基因，其靈敏度與PCR法一致。 RAM具有高度的特異性：在RAM反應(yīng)中，閉合環(huán)形探針的形成是以環(huán) 形探針與靶DNA特異性結(jié)合為前提，因此明顯地提高了反應(yīng)的特異性，另外引入捕獲探針采用磁性分離雜交復(fù)合物，也增加了反應(yīng)的特異性，因?yàn)榘蠨NA通過特定序列與捕獲探針雜交后，從而形成靶DNA-環(huán)形探針-捕獲探針復(fù)合物，被捕獲到磁珠上，從而更增加了RAM反應(yīng)的特異性。 RAM簡便、易行、不需要特殊設(shè)備：在RAM反應(yīng)中使用磁珠，通過磁 WP=99 性分離方法廢棄了以往煩瑣的人工DNA提取過程，探針兩端的連接與靶核酸的性質(zhì)（DNA和RNA）無關(guān)，因而無須在檢測RNA時(shí)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，克服了PCR法需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的過程，可以應(yīng)用簡單的方式檢測RNA和DNA；由于擴(kuò)增產(chǎn)物為ssDNA，無需象PCR反應(yīng)中必需通過改變溫度使雙鏈DNA變性、退火、引物延伸的溫度循環(huán)過程，使得反應(yīng)可在最簡單的水浴箱內(nèi)進(jìn)行，無需價(jià)格昂貴的PCR儀，因此RAM更簡便、易行，易于推廣應(yīng)用。 2.EB病毒感染與NHL具有較高的相關(guān)性。應(yīng)用RAM檢測了120例NHL患者外周血EB病毒基因，其檢出陽性率為63.33%（T-NHL為63.29%，B-NHL為63.41%），而健康對照組EB病毒基因的檢出陽性率為3.33%。我們的結(jié)果中，T-NHL的EB病毒檢出率接近并且高于國內(nèi)外研究者的報(bào)道，而B-NHL的檢出陽性率明顯高于國內(nèi)外研究者的報(bào)道，說明EB病毒感染與NHL的發(fā)生具有較高的相關(guān)性，且本地區(qū)EB病毒感染與NHL發(fā)生的相關(guān)性高于國內(nèi)其它地區(qū)。 3.EB病毒感染與NPC高度相關(guān)。應(yīng)用RAM檢測了32例鼻咽癌患者外周血EB病毒基因，其檢出陽性率為87.5%，與健康對照組相比具有顯著性差異，我們的結(jié)果與國內(nèi)外研究者所報(bào)道的陽性率相一致，說明本地區(qū)鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染高度相關(guān)。 4.EB病毒感染與急性髓系白血病相關(guān)性不大。應(yīng)用RAM檢測了30例急性髓系白血病患者外周血EB病毒基因，其檢出陽性率為3.33%，與健康對照組的陽性率相同，說明急性髓系白血病與EB病毒感染關(guān)系不大。 結(jié) 論： 1.RAM的敏感度高、特異性強(qiáng)、方法簡便易行、不需特殊設(shè)備，更適用于在基層醫(yī)療單位推廣應(yīng)用。 2.EB病毒感染與NHL的發(fā)生具有較高的相關(guān)性，與急性髓系白血病 WP=100 及健康對照組相比有顯著性差異，且本地區(qū)EB病毒感染與NHL發(fā)生的相關(guān)性高于國內(nèi)其它地區(qū)。 3.EB病毒感染與NPC高度相關(guān)。與急性髓系白血病及健康對照組相比有顯著性差異，我們的結(jié)果與國內(nèi)外研究者所報(bào)道的陽性率相一致，說明本地區(qū)鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染高度相關(guān)。 4.EB病毒感染與急性髓系白血病相關(guān)性不大。與健康對照組
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 廖建,鐘建明,嚴(yán)壯南,麥稚平;10戶鼻咽癌高發(fā)家庭EB病毒感染情況調(diào)查報(bào)告[J];廣西醫(yī)學(xué);2000年04期

2 顧依群,劉淑云,賈鯤鵬,李敏,李寧,鐘博南,高子芬;腸道非霍奇金淋巴瘤中的EB病毒感染和p21ras、p53蛋白表達(dá)及意義探討[J];白血病.淋巴瘤;2002年02期

3 張福明,李凡;分枝擴(kuò)增法檢測鼻咽癌患者外周血EB病毒基因[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年01期

4 彭培建,趙充,廖海,王富強(qiáng),張力;鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA水平的動(dòng)態(tài)變化與臨床療效的關(guān)系[J];癌癥;2002年08期

5 劉振聲，李寶民，劉彥仿，曾毅;EB病毒與促癌物協(xié)同作用誘發(fā)人鼻咽惡性淋巴瘤和未分化癌的研究[J];病毒學(xué)報(bào);1996年01期

6 唐發(fā)清,唐敏,夏林慶,顧煥華,王海,鄧錫云,曹亞;EB病毒潛伏膜蛋白1調(diào)控細(xì)胞凋亡的cDNA陣列分析[J];病毒學(xué)報(bào);2001年02期

7 林子萍,王登元,卜行寬,潘世楊;鼻咽上皮組織EBV基因片段檢測用于鼻咽癌早期診斷的研究[J];耳鼻咽喉-頭頸外科;2003年02期

8 程敏婷,程偉民,季明芳,梁錦勝;ELISA法檢測中國中山市正常人及鼻咽癌患者血清EB病毒抗體水平[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年09期

9 詹克勤;VCA-IgA抗體檢測鼻咽癌患者的應(yīng)用分析[J];實(shí)用臨床醫(yī)學(xué);2002年01期

10 黃宏宇,趙彤,齊宗利,賀莉,朱梅剛;非霍奇金淋巴瘤EB病毒特異DNA序列的檢測[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2003年05期

本文編號：2638477