【摘要】： 目的：體外分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和兔椎間盤(pán)髓核細(xì)胞。并建立永生化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。運(yùn)用Transwell培養(yǎng)法對(duì)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和兔椎間盤(pán)髓核細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng),研究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞的近距離作用后,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表型的變化,為構(gòu)建組織工程髓核提供優(yōu)良種子細(xì)胞建立基礎(chǔ)。 方法：從SD大鼠的腹股溝脂肪墊分離出脂肪組織,通過(guò)Ⅰ型膠原酶消化法獲取原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行傳代；同時(shí)取兔髓核細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。通過(guò)倒置相差顯微鏡對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,MTT法測(cè)定兩種細(xì)胞增殖情況,并采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行鑒定。使用LipofectamineTM 2000將含有猿腎病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的質(zhì)粒pCMVSV40T/PUR轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)過(guò)嘌呤酶篩選,抗性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)取得永生化脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。將永生化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)(對(duì)照組),并以1：1的比例和髓核細(xì)胞于Tranawell中進(jìn)行共培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組)。共培養(yǎng)15天后,采用組化、RT-PCR鑒定檢測(cè)兩組細(xì)胞中Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實(shí)取材分離并且純化的細(xì)胞為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞。SV40Tag穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)入脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,命名為永生化脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組永生化脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)15天在Transwell中與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后,RT-PCR結(jié)果顯示有Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖表達(dá),而對(duì)照組則無(wú)Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖表達(dá);免疫組織化學(xué)染色顯示實(shí)驗(yàn)組聚集蛋白聚糖表達(dá)陽(yáng)性而對(duì)照組為陰性。 結(jié)論：運(yùn)用顯微取材和免疫學(xué)純化技術(shù)可以成功分離出純化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞。通過(guò)SV40Tag穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,可構(gòu)建永生化脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。在Transwell環(huán)境內(nèi)非接觸共培養(yǎng),髓核細(xì)胞能夠在體外誘導(dǎo)永生化脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向永生化髓核樣細(xì)胞方向分化,因此可以利用永生化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療椎間盤(pán)退行性疾病。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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1 趙亮;瞿東濱;陳建庭;江建明;蔣暉;金大地;;人工髓核假體置入治療腰椎間盤(pán)突出癥的療效分析[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2007年16期

2 趙亮;瞿東濱;陳建庭;江建明;金大地;;腰椎間盤(pán)人工髓核置換術(shù)后手術(shù)節(jié)段活動(dòng)度和椎間隙高度變化的觀察[J];中國(guó)脊柱脊髓雜志;2007年03期

3 鄧方躍,劉尚禮,鄭召民,黃東生,李春海,郭家偉;人工髓核置換術(shù)治療退變性腰椎間盤(pán)病的近期效果[J];中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志;2004年06期

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1 黃強(qiáng)民;王建龍;徐恒旭;張雄文;陸景華;楊聰林;;人工髓核植入術(shù)治療腰椎間盤(pán)脫出癥一例報(bào)告[A];玉溪市第二屆骨科學(xué)術(shù)研討及科技成果推廣會(huì)論文匯編[C];2005年

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1 張輝;腰椎間盤(pán)突出人工髓核置換術(shù)的基礎(chǔ)與臨床研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

2 孫艷;骨髓干細(xì)胞移植治療急慢性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2007年

3 趙慶華;SOX9蛋白對(duì)人頸椎退變疾病透明軟骨細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

4 于長(zhǎng)江;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向結(jié)膜樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2007年

5 趙亮;腰椎間盤(pán)人工髓核置換術(shù)的臨床與基礎(chǔ)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2007年

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1 劉增勝;腰椎間盤(pán)高度降低與其椎間盤(pán)退行性變的相關(guān)性研究[D];青島大學(xué);2003年

2 陳琦;PDN腰椎人工髓核臨床應(yīng)用分析[D];東南大學(xué);2006年

3 秦安;頸椎椎間盤(pán)退變與終板Modic退變的MRI研究[D];浙江大學(xué);2007年

4 李偉;腰椎椎板截骨原位回植術(shù)遠(yuǎn)期療效分析[D];山東大學(xué);2007年

5 李志強(qiáng);兩種頸椎前路減壓結(jié)構(gòu)重建方式的臨床評(píng)價(jià)[D];同濟(jì)大學(xué);2005年

6 徐展;亞甲藍(lán)對(duì)長(zhǎng)入疼痛椎間盤(pán)內(nèi)神經(jīng)纖維影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2008年

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本文編號(hào)：2637729