【摘要】：志賀菌(Shigella)是細菌性痢疾的主要病原菌,它通過毒性大質粒上的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system, T3SS)將分泌的效應蛋白分子注入到宿主細胞內,從而導致細菌對人體腸道的侵襲并引起強烈的炎癥反應,引起腹瀉、腹痛、發(fā)熱等癥狀,嚴重的可導致死亡。志賀菌屬包含痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae, A群)、福氏志賀菌(Shigella flexneri, B群)、鮑氏志賀菌(Shigella boydii, C群)和宋內志賀菌(Shigella sonnei, D群)四個血清群,其中宋內志賀菌是發(fā)達國家的優(yōu)勢血清群,福氏志賀菌是發(fā)展中國家的主要致病血清群。 根據O-抗原結構的差異,福氏志賀菌又可以分為眾多血清型,目前報道的福氏志賀菌血清型至少有19種,包括1a,1b,1c,1d,2a,2b,3a,3b,4a,4av,4b,5a,5b, Y, Yv, X, Xv,6和7b。除血清型6外,其它血清型O-抗原具有共同的結構：一個N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc)和三個鼠李糖(Rhamnose, Rha)構成的四糖骨架重復單元,即Y血清型結構。四糖骨架中特定糖的糖基化或/和乙酰化或/和磷酸乙醇胺化修飾決定了福氏志賀菌的型和群特異性抗原決定簇,從而形成了福氏志賀菌血清型的多樣性。福氏志賀菌O-抗原的糖基化和乙酰化修飾是由血清型轉換噬菌體所介導的,而磷酸乙醇胺化修飾是由質粒介導的。目前已經發(fā)現的福氏志賀菌血清型轉換噬菌體有SfI,SfIC, SfII, Sf6, SfIV, SfV和SfX,除噬菌體Sf6外,其他噬菌體均攜帶由3個基因(gtrA,gtrB和gtr)組成的基因簇,gtr基因編碼特異性葡萄糖基轉移酶(Glucosyltransferase,Gtr),介導葡萄糖基以不同的連接方式添加到O-抗原四糖重復單位的不同糖基上導致血清型的轉換。福氏志賀菌在不同地區(qū)、不同時間具有優(yōu)勢血清型的變化,如2a血清型福氏志賀菌長期以來是包括中國在內亞洲國家的優(yōu)勢血清型。近年來一些新的血清型菌株出現并在一些地區(qū)造成流行,如Xv血清型菌株在中國河南2002～2006年取代2a血清型菌株成為優(yōu)勢血清型。我們實驗室研究證實了Xv血清型是由X血清型經磷酸乙醇胺化修飾轉換而來的,并分離到血清型轉換噬菌體SfX:1c血清型在80年代末的孟加拉出現并在一段時期成為越南及埃及的主要流行血清型,有研究提示1c血清型菌株是由1a血清型菌株感染噬菌體SflC而來。不同血清型福氏志賀菌流行差異及流行血清型變遷的原因目前仍不清楚,除血清型轉換這一作用外,血清型轉換噬菌體介導的O-抗原變化是否也會導致細菌毒力的改變有待進一步研究。 本研究對一株Y血清型的福氏志賀菌036進行了血清型轉換研究：將036感染血清型轉換噬菌體SfX,可將福氏志賀菌Y血清型轉化為X血清型(菌株036X),將新轉換的福氏志賀菌Y血清型菌株036X感染血清型轉換噬菌體SfI,得到一種新的血清型菌株,與Ⅰ型特異性抗血清和群7,8特異性抗血清發(fā)生凝集,我們將它命名為福氏志賀菌1d血清型(菌株-036_1d)。隨后我們在中國監(jiān)測的福氏志賀菌株中發(fā)現5株1d血清型菌株。進一步研究發(fā)現,受體菌株獲得血清型轉換噬菌體,O-抗原被修飾后,可影響細菌的毒力。細菌對HeLa細胞的侵襲方面,獲得血清型轉換噬菌體SfX的036_X及獲得血清型轉換噬菌體SfX和SfI的036_1d的侵襲能力均高于Y血清型菌株036,且036_1d與036的差異有統(tǒng)計學意義；豚鼠角膜實驗也發(fā)現0361d所致豚鼠角膜結膜炎癥程度高于036,提示O-抗原的糖基化可以影響細菌的侵襲力。用乳酸脫氫酶釋放量來檢測細菌對巨噬細胞的毒性發(fā)現,036_1d對小鼠巨噬細胞Raw264.7的細胞毒性明顯高于036,且差異有統(tǒng)計學意義。Raw264.7細胞和036_1d菌株相互作用后,培養(yǎng)液上清的IL-1p及IL-6的釋放量也稍高于036菌株。對上述3株菌全菌蛋白質組的比較分析研究發(fā)現,036_1d菌株有一個表達明顯上升的蛋白Sap,該蛋白在036及036X菌株中沒有表達。使用QRT-PCR分析發(fā)現,036_1d菌株的sap基因的表達水平比036及036_X菌株顯著提高。據此推測sap基因具有重要功能。我們繼而構建了攜帶sap基因表達載體的036菌株-036⑥-1菌株,研究Sap蛋白表達對細菌毒力的影響。結果發(fā)現036⑥-1菌株的sap基因的轉錄水平顯著高于036、036_X及036_1d菌株。036⑥-1對上皮細胞的侵襲力及對巨噬細胞的毒性均高于036,但仍明顯低于036_1d。志賀菌Sap蛋白與大腸桿菌Antigen43(Ag43)蛋白具有96%的高度同源性。大腸桿菌Ag43蛋白在大腸桿菌中具有介導自我聚集與促進生物膜形成的作用,通過介導細胞的聚集能起到抵抗過氧化氫物質殺死的作用。關于志賀氏菌Sap蛋白的作用有待于進一步的實驗研究。本研究發(fā)現血清型轉換噬菌體介導的O-抗原糖基化修飾菌株對上皮細胞的侵襲性及巨噬細胞毒性均高于O-抗原未糖基化修飾菌株,提示O-抗原糖基化修飾可以促進福氏志賀菌的毒力。
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.25

【參考文獻】

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1 羅學輝;張建群;張一;張怡明;;2007-2011年浙江省余姚市感染性腹瀉志賀菌監(jiān)測結果分析[J];疾病監(jiān)測;2013年01期

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本文編號：2637625