【摘要】：恙蟲病又稱叢林斑疹傷寒(Scrub typhus)，是通過恙螨叮咬而傳播，臨床上主要以突然高熱、淺表淋巴結(jié)腫大、蟲咬處潰瘍焦痂和皮疹為特征，其病原體為恙蟲病東方體(Orientia tsutsugamushi)。盡管該病可用抗菌藥如四環(huán)素、多西環(huán)素和氯霉素等進行有效治療，但是再感染和復(fù)發(fā)經(jīng)常發(fā)生。另外，還出現(xiàn)耐藥性恙蟲病東方體菌株。因此，用恙蟲病疫苗對易感人群進行預(yù)防接種仍有必要。傳統(tǒng)的恙蟲病疫苗研究主要是集中在滅活和減毒的菌苗，但一直未獲滿意結(jié)果。因此，有必要應(yīng)用新技術(shù)來開發(fā)新型恙蟲病疫苗。 56kDa和47kDa蛋白是恙蟲病東方體的主要外膜蛋白。研究證明，這兩種外膜蛋白均存在菌體表面并具有良好的免疫原性，已成為恙蟲病東方體亞單位疫苗的重要候選分子。58kDa蛋白是恙蟲病東方體的熱休克蛋白，屬于Hsp60家族。恙蟲病東方體58kDa蛋白抗原具有種特異性，提示該蛋白可能是一種潛在的保護性抗原。 本研究首先用PCR方法擴增了恙蟲病東方體Karp株的47kDa、56kDa、58kDa蛋白基因，并對這些基因片段進行了克隆和序列測定。將這些基因分別插入到表達質(zhì)粒pQE30中，構(gòu)建了單抗原基因重組原核表達質(zhì)粒(pQE30／47、pQE30／56、pQE30／58)和雙抗原基因重組的原核表達質(zhì)粒(pQE30／56-47、pQE30／58-47)。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli和IPTG誘導(dǎo)重組子表達目的蛋白。SDS-PAGE分析證明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli細胞分別表達了47kDa、56kDa、58kDa重組蛋白以及56-47kDa和58-47kDa融合蛋白；蛋白免疫印跡分析證明重組蛋白均可與恙蟲病東方體Karp株免疫血清發(fā)生特異反應(yīng)。 為研究表達蛋白的免疫原性，用Ni-NTA親和層析柱將重組蛋白純化后免疫Balb／C小鼠。在第一次加強免疫后第10天，用ELISA在免疫小鼠的血清中檢測到特異性抗體，表明重組蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。用MTT法分析免疫小鼠的脾細胞，發(fā)現(xiàn)這些重組蛋白均能刺激同源蛋白免疫小鼠的脾臟淋巴細胞增殖，提示這些重組蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答。56-kDa重組蛋白誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答的水平最高，而47-kDa重組蛋白誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的細 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院博七研究生學(xué)位論文 胞免疫應(yīng)答的水平最高。56一47kDa融合蛋白誘導(dǎo)的體液和細胞免疫應(yīng)答水平分 別與56一kDa重組蛋白和47一kDa重組蛋白所誘導(dǎo)的相當(dāng)。 在第二次加強免疫后第14天，用10LD。，Karp株攻擊免疫的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 56一47kDa融合蛋白免疫組的死亡率比56一kDa重組蛋白或47一kDa重組蛋白免疫 組低，與陰性對照組有顯著差異。病理學(xué)檢查顯示56一47kDa融合蛋白免疫保護 小鼠的肺、肝、腎未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化，而死亡小鼠的這些臟器均有嚴(yán)重病變。 這些結(jié)果證明56一47kDa融合蛋白能更有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗恙蟲病東方體免疫 應(yīng)答，提示56一47kDa蛋白含有Karp株56一kDa和47一kDa外膜蛋白的抗原表位， 既具有56一kDa外膜蛋白的良好體液免疫誘導(dǎo)性又具有47一kDa外膜蛋白的良好細 胞免疫誘導(dǎo)性。 用Karp株56和47一kDa蛋白基因分別構(gòu)建了單個基因重組的真核表達質(zhì)粒 pcDNA/47和pcDNA/56，并將這兩個基因融合構(gòu)建了雙抗原基因重組的真核表達 質(zhì)粒pcDNA/瑟一47，用重組真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染真核細胞(COS一7細胞)。用 56一和47一kDa蛋白免疫血清分別對轉(zhuǎn)染的細胞作間接免疫熒光染色，結(jié)果證明 56一和47一kDa蛋白基因以及它們的融合基因均在相應(yīng)的轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)表達了目 的蛋白。 將真核表達質(zhì)粒pcDNA/47、pcDNA/56、pcDNA/56一47以肌肉多點注射的方 式免疫Balb/c小鼠。在第二次加強免疫后第10天采集免疫小鼠的血清做EL工SA 和收集脾細胞做淋巴細胞增殖試驗，結(jié)果顯示重組真核表達質(zhì)粒聯(lián)合同源重組蛋 白免疫的小鼠比單獨用重組真核表達質(zhì)粒免疫小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性抗體 和特異性淋巴細胞增殖。Karp株的攻毒試驗顯示pcDNA/47或pcDNA/56免疫的 小鼠死亡率高于pcDNA/56一47免疫組，而裸pcDNA/56一47的免疫效果又顯著低于 納米脂質(zhì)體包封的pcDNA/56一47。 本研究的結(jié)果表明56一47kDa融合蛋白具有恙蟲病東方體Karp株56一kDa 和47一kDa外膜蛋白的抗原表位和免疫原性，該融合蛋白能比單一外膜蛋白更有 效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗恙蟲病東方體的體液和細胞免疫應(yīng)答。用56一47kDa融合蛋 白基因構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒免疫機體，也能有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗恙蟲病東方體 匯!頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院博l:研究生學(xué)位論文 的體液和細胞免疫應(yīng)答。56一47kDa融合基因與56一47kDa融合蛋白的聯(lián)合免疫可 能是替代恙蟲病東方體全菌抗原免疫的一種較理想的預(yù)防恙蟲病東方體感染的 方式。
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汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士研究生學(xué)位論文以恙蟲病東方體基因組DNA為模板，經(jīng)PCR分別擴增出47kDa、56kDa、58kDa蛋白基因，大小分別約等于1272bp(圖1一l)、1179bp(圖1一2)、149lbp(圖1一3)，，與預(yù)期結(jié)果一致。122000bP1000bP1272bP圖1一1Ot.Karp株47kDa成熟蛋白基因的擴增Fig.l一1AmPlificationof47kDaProteingenebyPCRLanel，DL2000standardmarker;laneZ，amPlifiedProduetof47kDamatureProteingene·l22000bP1000bP1179bP圖1一2口t.Karp株56kDa蛋白基因的擴增Fig.l一2AmPlifieationof56kDaProteingenebyPCRLanel，DL2000standardmarker:laneZ，amPlifiedProduetof56功aProteingene·

在含氨節(jié)青霉素平板上選擇陽性克隆。陽性克隆的質(zhì)粒通過PCR及酶切鑒定證明目的基因已成功克隆到PGEM一T載體中，重組質(zhì)粒分別命名為pGEM/47、pGEM/56、pGEM/58(圖1一3)。12342000bP一1000bP一圖1一4PCR鑒定陽性克隆子pGEM/47、pGEM/56、pG毗/58Fig.1一4IdentineationofPGE扮1147、PGEM/56、PGEMI58byPCRLanel，DL2000standardmarker:laneZ，PCRProduetsofPGEM/47elones;lane3，PCRProduetsofPGEM/58elones;lane4，PCRProduetsofPGEM/56clones·2.3目的基因的序列測定對克隆到T載體上的47kDa、56kDa、58kDa蛋白基因的序列測定表明，擴增的蛋白基因的堿基序列與己知的Karp株蛋白基因序列一致(見圖1一5、6、7)。
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【參考文獻】

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