【摘要】：心律失常是常見的死亡和致殘原因。據(jù)統(tǒng)計，美國每年有三十多萬人發(fā)生猝死，而猝死的主要原因是原發(fā)性或繼發(fā)性心律失常。長QT綜合征(LQTS)被認(rèn)為是非結(jié)構(gòu)性心臟病患者猝死的主要原因，到目前為止，至少有六種基因的突變可引起LQT8，包括兩個鉀離子通道基因(KCNQ1，HERG)，兩個β調(diào)節(jié)亞基基因(KCNE1，KCNE2)，一個鈉離子通道基因(SCN5A)和一個鈣離子通道釋放基因(RYR2)。最新研究表明，大多數(shù)離子通道均參與心律失常的發(fā)生和維持，這些基因功能的變化不僅能引起離子通道病(Channelpathy)，而且還可能加劇一些離子通道相關(guān)性疾病(如心衰，心肌病和冠心病)的心電生理紊亂，甚至猝死。 1．HERG通道孔區(qū)外口的錯義突變對其功能的影響 在心肌細胞復(fù)極化過程中，許多離子通道參與其動作電位的形成，其中HERG基因編碼的鉀離子通道在這一過程中發(fā)揮重要的作用。大部分心肌細胞均可檢測到快速激活的延遲整流性電流(Ikr)，而形成該電流的主要亞基被認(rèn)為是HERG通道。HERG基因的突變可引起遺傳性LQTS，抑制Ikr的藥物可引起獲得性LQTS。HERG通道最重要的功能是其內(nèi)向整流特性，通道的內(nèi)向整流功能主要取決于其快速失活過程，C-型失活模式是HERG通道快速失活的重要機制。由于通道孔區(qū)的構(gòu)象改變是C-型失活的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因此研究HERG通道孔區(qū)外口的功能對認(rèn)識HERG通道的功能具有極為重要的意義，可以了解該區(qū)域變異導(dǎo)致LQTs及其它心律失常的分子機制，為臨床干預(yù)和治療提供必要的依據(jù)。 本研究采用Megaprimer方法制備HERG V630A、P632S、N633S突變體，并亞克隆到pSP64和pcDNA3.1表達載體，用T7 RNA聚合酶體外合成cRNA，經(jīng)Ribogreen熒光定量和變性膠電泳鑒定后，將相應(yīng)的cRNA注入卵母細胞，在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，用標(biāo)準(zhǔn)雙電極電壓鉗技術(shù)測量卵母細胞的表達電流。另外，，采用CHO細胞表達系統(tǒng)，用LipofectAMINE方法轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時后，選擇孤立的熒光細胞，應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄表達電流。所有數(shù)據(jù)均采用pCLAMP軟件采集，并應(yīng)用Kaleidagraph3.5和Igor軟件進行數(shù)據(jù)處理。研究表明定位在HERG通道外口的三個錯義突變
【圖文】：

圖l:構(gòu)建pe訓(xùn)A3.l+muattion質(zhì)粒圖2:構(gòu)建pCDNA3.l+mutation質(zhì)粒單酶切鑒定結(jié)果雙酶切鑒定結(jié)果1.V630川ECOR卜Hind川2.P632SIECOR!+Hind】!!V630川Bgfl2.P632SIBgll3.N633SIBgllDNAMarker(Ikbladde)r3.N633SIEcOR!+Hind!11

圖3.體外合成cRNA電泳鑒定結(jié)果1.V630A2.P63253.Msrk6r4.N63355.HERGW2.HERGWTcRNA濃度對表達電流的影響為了定量分析電流，更好比較野生型和突變型之同濃度的HERGWTcRNA注射卵母細胞，3天后，母細胞表達的電流，發(fā)現(xiàn)cRNA的注射量與表達snaugnietti的研究結(jié)果一致，注射sngwTcRNA的
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R346;Q78

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 劉遠謀,王紅衛(wèi),李慈珍;游離心肌細胞晚鈉通道爆發(fā)型開放模式的電位依賴性[J];生理學(xué)報;1997年05期

2 徐有秋;心肌細胞電活動的離子流基礎(chǔ)[J];心電學(xué)雜志;1986年03期

3 楊雙強,譚松濤,楊朝坤,汪斌,陳力;極化停搏液用于離體大鼠心臟保存的實驗研究[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2005年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 楊雙強;河豚毒素心臟停搏液用于離體大鼠心肌保護的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2005年

2 王朗;δ-氨基酮戊酸（ALA）對大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性的作用[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2006年

3 汪永孝;環(huán)原黃楊堿A抗心律失常作用及其機理的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1990年

4 歐紹武;人神經(jīng)母細胞瘤（NB-1）細胞株TTX-R鈉通道的分子克隆和功能分析[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 譚松濤;阻斷Na～+通道極化停搏對離體大鼠缺血/再灌注心肌的保護作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2003年

2 權(quán)曉強;脫中性粒細胞溫血心臟停搏液心肌保護臨床研究[D];鄭州大學(xué);2003年

3 楊朝坤;TTX極化心臟停搏液對離體大鼠心肌細胞保護作用及其機制的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

4 郭煒;線粒體ATP敏感性鉀通道在心臟低溫保存中的作用研究[D];浙江大學(xué);2005年

5 陸曉華;人體心肌細胞模型與Brugada綜合癥仿真研究[D];浙江大學(xué);2005年

6 張曉蕓;蝎毒耐熱蛋白對大鼠海馬神經(jīng)元電壓門控性鈉通道電生理特性的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2006年

本文編號：2637064