【摘要】：蚊媒病是全世界重要的傳染病之一，包括瘧疾，西尼羅河熱等嚴(yán)重危害人類健康的疾病。蚊媒病控制的主要措施是治理蚊媒。化學(xué)防治因其速殺、長效、方便等特點(diǎn)，一直是蚊媒綜合治理策略中的主要方法。然而隨著殺蟲劑連續(xù)、大量的使用，蚊媒抗藥性開始產(chǎn)生和發(fā)展。蚊媒抗藥性產(chǎn)生和發(fā)展加劇了蚊媒病傳播的惡化趨勢�；瘜W(xué)防治因其能夠快速，有效控制蚊媒種群，在以后很長的時間內(nèi)仍是蚊媒治理的主要方法。因此蚊媒抗藥性研究仍是控制蚊媒病傳播的重點(diǎn)。 蚊媒抗藥性機(jī)制包括3個主要方面。一方面是靶標(biāo)抗性，即蚊媒殺蟲劑靶位點(diǎn)的改變；另一方面代謝抗性，其涉及代謝相關(guān)酶類轉(zhuǎn)錄水平的變化；此外為生理抗性，如表皮改變影響殺蟲劑的穿透性。其中，以代謝抗性研究最多。前期代謝抗性研究關(guān)注殺蟲劑代謝相關(guān)酶活性的改變，未見抗性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究。本實(shí)驗(yàn)初步探索了抗藥性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。 miRNA是一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要因子，廣泛存在于動物和植物中。其通過降低mRNA表達(dá)或者抑制蛋白質(zhì)合成參與調(diào)控體內(nèi)近30%的基因。miRNA功能包括調(diào)節(jié)生物體的生長、發(fā)育、凋亡等。目前在蚊中已經(jīng)開始研究miRNA與抗感染方面的研究，至今未見miRNA和殺蟲劑關(guān)系的報道。 本研究選取在我國分布廣泛的重要家棲性病媒蚊種淡色庫蚊為研究對象，以近年我國使用最多的衛(wèi)生殺蟲劑溴氰菊酯為材料，采用solexa測序法，比較了溴氰菊酯敏感和抗性淡色庫蚊miRNA表達(dá)譜；通過PCR、T-A克隆及測序驗(yàn)證了pre-miRNA；采用定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了敏感和抗性品系中miRNA表達(dá)差異；采用雙熒光報告驗(yàn)證了miR-71可以調(diào)控殺蟲劑代謝酶類CYP325BG3表達(dá)。 本研究主要結(jié)果如下： 1通過WHO幼蟲浸漬法建立了淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系，其LC50為0.85mg/L，敏感品系LC50為0.03mg/L，抗性系數(shù)為28.3。 2使用solexa法對淡色庫蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系進(jìn)行了成功的測序。送測序mRNA，敏感蚊混合樣本濃度為670ug/ml, OD260/0D280為1.80；抗性蚊混合樣本濃度為600ug/ml，OD260/0D280為1.83。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和安捷倫Bianalyzer檢測，RNA完整性良好，測序結(jié)果中rRNA的比例小于40%。表明solexa測序結(jié)果良好，可以用于繼續(xù)分析。 3對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭、污染序列及低質(zhì)量reads的處理，并統(tǒng)計sRNA序列長度分布，可以觀測到20-23nt長度的序列所占比例高。將測序結(jié)果與最近緣致倦庫蚊的基因組進(jìn)行比對。將上述測序得到的序列（clean序列）按照rRNAetc known miRNA repeat exon intron的優(yōu)先級順序注釋。在鑒定淡色庫蚊miRNA的時候，根據(jù)致倦庫蚊基因組序列，提取miRNA前體序列，進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析。進(jìn)一步用miRAlign軟件將上述序列與miRBase比對，篩選出淡色庫蚊成熟miRNA和預(yù)測新的miRNA。在淡色庫蚊中共鑒定保守miRNA85個，前體結(jié)構(gòu)91個；新miRNA143個，前體結(jié)構(gòu)209個。同時比較了淡色庫蚊敏感和抗性品系中miRNA表達(dá)量的差異。 4在淡色庫蚊miRNA檢測中，檢測到miR-932、miR-980、miR-998、miR-999等昆蟲特有miRNA；miR-1891、miR-1889和miR-2941等蚊特有miRNA。根據(jù)miRNA基因簇分析方法，設(shè)10K bp為miRNA基因之間排列的最大距離，共發(fā)現(xiàn)7個淡色庫蚊miRNA簇，其中包括在昆蟲中最常見的let-7、miR-125構(gòu)成的miRNA簇。PCR鑒定了淡色庫蚊pre-miRNA，T-A克隆測序了部分淡色庫蚊pre-miRNA序列。測序結(jié)果顯示，與致倦庫蚊miRNA前體結(jié)構(gòu)相比，淡色庫蚊miRNA的莖部結(jié)構(gòu)保守，而環(huán)部堿基突變比較常見。其為淡色庫蚊和致倦庫蚊的系統(tǒng)分類提供了一種新的可行性。 5選取solexa測序后比較有統(tǒng)計學(xué)差異的miRNA和昆蟲學(xué)研究中已有功能報道m(xù)iRNA進(jìn)行定量驗(yàn)證。在敏感品系大部分發(fā)育階段，，miR-279-3p、miR-13、miR-989、miR-4448和miR-285的表達(dá)水平比抗性品系高；miR-317、miR-2b、miR-92a在抗性品系各發(fā)育階段表達(dá)水平比敏感品系高。 6靶標(biāo)預(yù)測提示，CYP325BG3的3’UTR序列和miR-71可能存在相互作用。采用雙熒光報告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-71和CYP325BG3之間確實(shí)存在相互作用。結(jié)果表明，miR-71可能通過調(diào)節(jié)CYP325BG3的表達(dá)水平參與淡色庫蚊溴氰菊酯抗性。 本研究首次報告了淡色庫蚊抗藥性miRNA表達(dá)譜，PCR和T-A克隆測序驗(yàn)證了miRNA前體結(jié)構(gòu)，定量PCR鑒定了抗藥性相關(guān)miRNA。雙熒光報告方法驗(yàn)證miR-71可以調(diào)控代謝酶類CYP325BG3的表達(dá)，進(jìn)而參與殺蟲劑抗性。研究結(jié)果豐富了昆蟲miRNA數(shù)據(jù)庫，初步探索了miRNA在蚊抗藥性中的作用，具有重要的理論意義和潛在的實(shí)際應(yīng)用價值。
【圖文】：

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14圖 1 淡色庫蚊總 RNA 電泳圖M：Marker；1-14 為上述表 3 所述順序的總 RNA1.2.3 RNA 完整性分析用 Agilent Bianalyzer 對測序樣本進(jìn)行 RNA 完整性分析。檢測結(jié)果顯示，由于蚊物種特異性， 28S/18S 和 RIN 值比較低，基線平整，無上抬，以上說明樣品沒有降解，RNA 完整性好，可用于下一步測序（圖 2）。1.3 淡色庫蚊敏感和抗性品系 miRNA 測序與生物信息學(xué)分析1.3.1 數(shù)據(jù)處理對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭、污染序列及低質(zhì)量 reads 的處理，并統(tǒng)計小 RNA的長度分布。表 4 顯示敏感品系和抗性品系的總讀數(shù)量（total reads）相近，去掉接頭（3adapter null，5adapter contaminants）、多聚 A 尾（ployA）、小于 18 個

40圖 3 Solexa 測序結(jié)果的序列長度分布序列分布顯示敏感和抗性品系中 20-23 個堿基長度的序列抗性品系長度分布比較，可以看出敏感品系中長度為 25-29 堿基抗性品系。致倦庫蚊的基因組進(jìn)行比對。表 5 顯示測序的序列中能匹配的數(shù)列數(shù)目和所占比例。圖 4 顯示敏感品系和抗性特有的測序序列所占比例。其中每條特異性序列用 Uni
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R384.1;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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1 王靖,袁家s

本文編號：2633705