【摘要】： 為了避免補(bǔ)體的過渡活化以及保護(hù)宿主，補(bǔ)體系統(tǒng)被分別表達(dá)在液相 和膜上的補(bǔ)體調(diào)控蛋白嚴(yán)密調(diào)控。衰變加速因子是一種重要的膜上補(bǔ)體調(diào) 控蛋白，，它作用于補(bǔ)體激活前端反應(yīng)的C3/C5轉(zhuǎn)化酶，通過抑制其組裝而 加速其衰變。既可以抑制補(bǔ)體的溶破效應(yīng)，更可阻止C3a、C5a等過敏毒素 和趨化因子的產(chǎn)生，因而是一種潛在的理想的補(bǔ)體抑制藥物，可用于防治 多種疾病過程中補(bǔ)體系統(tǒng)的異常激活。此外，近年來發(fā)現(xiàn)表達(dá)人DAF（CD55） 等補(bǔ)體調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物器官能很好的控制異種移植中由于補(bǔ)體活化 所引起的超急性排斥反應(yīng)，這使其成為補(bǔ)體分子研究中的“明星”。然而， DAF仍存在某些缺陷，比如其有限的衰變加速能力并缺乏Ⅰ因子的輔因子 活性限制了DAF的臨床應(yīng)用，其為部分病原微生物受體的角色對(duì)異種移植 有潛在危險(xiǎn)。因而對(duì)DAF進(jìn)行改造是一種較好的選擇，也是當(dāng)務(wù)之急。本 課題擬從探討DAF發(fā)揮補(bǔ)體調(diào)控作用的關(guān)鍵氨基酸入手，運(yùn)用酵母呈現(xiàn)技 術(shù)體外進(jìn)化DAF分子，期望在了解DAF結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，篩選高活性 的抑制補(bǔ)體激活的DAF突變體，最后在實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)相關(guān)資料的基礎(chǔ)上 對(duì)DAF發(fā)揮補(bǔ)體調(diào)控作用的機(jī)制作進(jìn)一步探討。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果包括以下 幾方面： 1．天然人DAF分子的酵母細(xì)胞表面呈現(xiàn) 本課題首先以人DAF cDNA為模板，通過PCR克隆構(gòu)建了含人天然DAF分子成熟蛋白cDNA的 酵母表面呈現(xiàn)載體，并將其轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，誘導(dǎo)天然DAF分子在酵母表面 表達(dá)。用三株針對(duì)DAF不同表位的單克隆抗體，通過免疫熒光、細(xì)胞 ELISA、流式細(xì)胞檢測(cè)等技術(shù)分別對(duì)酵母細(xì)胞表面呈現(xiàn)的DAF進(jìn)行了鑒 定。結(jié)果顯示在酵母細(xì)胞表面能檢測(cè)到與以上單抗結(jié)合的DAF分子，說明 了DAF分子在酵母細(xì)胞表面呈現(xiàn)，并且呈現(xiàn)的DAF分子能正確折疊，形 成了天然的構(gòu)象。這是國內(nèi)外首次用酵母表面呈現(xiàn)技術(shù)在酵毋細(xì)胞表面呈 現(xiàn)除兔疫球蛋白超家族分子以外的其它天然蛋白分子。 2．SCRS多重序列比較及DAF ＄變位點(diǎn)的涉擇 通過對(duì)補(bǔ)體調(diào)控蛋白 家族成員、不同種屬DAF分子的同源結(jié)構(gòu)單位SCR的氨基酸序列進(jìn)行多 重序列比較，確定了DAF分子中的保守性氨基酸和非保守性氨基酸，并根 據(jù)己有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)DAF分子可能活性位點(diǎn)進(jìn)行了分析，確定了構(gòu)建酵 母細(xì)胞表面呈現(xiàn)庫的突變氦基酸位點(diǎn)。 3．基于DAF框架的酵母呈現(xiàn)突變體庫的構(gòu)建與鑒定 通過重疊PCR 和大引物PCR引人突變，構(gòu)建了基于天然DAF蛋白分子框架的酵母表面 呈現(xiàn)肽庫，并對(duì)庫的庫容、隨機(jī)性等進(jìn)行了鑒定。表明所構(gòu)建的基于DAF 框架的酵母呈現(xiàn)突變體庫庫容完整、隨機(jī)性好，符合篩選的要求。這是國 內(nèi)外首次構(gòu)建的以免疫球蛋白超家族成員以外的蛋白分子為框架的酵母表 面呈現(xiàn)肽庫。 4．篩選方法的建立 以酵母細(xì)胞表面的多糖直接活化正常人血清補(bǔ) 體，運(yùn)用抗人 C5b－9的單抗檢測(cè)末端補(bǔ)體復(fù)合物（TCC）在酵母細(xì)胞表面 的沉積，首次建立了從功能直接篩選酵母表面呈現(xiàn)蛋白突變體的方法，并 進(jìn)一步從功能方面證實(shí)酵母表面呈現(xiàn)的天然DAF具有補(bǔ)體調(diào)控活性。 5．夾變體的篩選及鑒定利用建立的功能篩選方法，通過流式細(xì)胞儀 直接檢測(cè)與分選，從四輪分選后的子庫中隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行功能鑒定。首 次從以DAF結(jié)構(gòu)為框架所構(gòu)建的的酵母表面肽庫中篩選到DAF的高活性 突變體。并證實(shí)了DAF分子的非保守性氨基酸突變可提高其活性。進(jìn)一步 證實(shí)了DAF分子表面的正電荷對(duì)于其與C3b／C4b的結(jié)合性的重要，同時(shí) 表明位于C3b們4b表面的補(bǔ)體調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)可能是負(fù)電荷集中區(qū)域。 6．DAF促衰變加速的分子機(jī)制初步抉討 通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析， 結(jié)合當(dāng)前最新的研究進(jìn)展，在比較DAF與Ba、CZb同源序列的前提下， ·IX· 二 首歡提出了比較精細(xì)的DAF可能的衰變加速作用的分子機(jī)制模型，此模型 ‘首次解釋了經(jīng)典和替代途徑所需DAF SCR數(shù)目的差異的可能原因、DAF 二聚體的功能、DAF內(nèi)源性活性的可能原因、突變體活性增高與B因子的 關(guān)系。 總之，我們通過酵母表面呈現(xiàn)技術(shù)體外進(jìn)化DAF，獲得的高活性突變 體深化了對(duì)DAF結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理解，具有重要的理論意義，同時(shí)其可 能作為新型補(bǔ)體抑制劑運(yùn)用于臨床或作為異種移植中第二代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的 基因來源，具有潛在的實(shí)用價(jià)值。建立的相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法完善和發(fā)展了酵 母表面呈現(xiàn)技術(shù)，對(duì)開展與補(bǔ)體調(diào)控蛋白相關(guān)的研究具有重要的參考價(jià)值。 提出的DAF促衰變機(jī)制的模型對(duì)進(jìn)一步研究有一定的指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R392-33

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄒全明,朱錫華,蔡武城,李昌本,趙壽元;人白細(xì)胞介素2受體α鏈cDNA導(dǎo)入哺乳細(xì)胞及其克隆與穩(wěn)定表達(dá)的研究[J];免疫學(xué)雜志;1991年01期

2 鄒強(qiáng),謝佩蓉,鄭萍;抗人DAF單克隆抗體的制備及鑒定[J];免疫學(xué)雜志;1999年02期

本文編號(hào)：2633840