【摘要】：早期胚胎是細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化最旺盛時(shí)期，大多數(shù)基因都處于活化狀態(tài)，是發(fā)現(xiàn)和分離有重要功能新基因的極好材料。盡管小鼠等模式動(dòng)物，對(duì)于我們認(rèn)識(shí)哺乳類動(dòng)物早期胚胎發(fā)育提供了許多重要信息，但它與人類存在著必然的差異。為此，我們根據(jù)實(shí)際情況和條件選擇人早期胚胎為材料，進(jìn)行人早期胚胎中表達(dá)的新基因的分離和功能研究。 在構(gòu)建早期人胚胎cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用雜交篩選和表達(dá)標(biāo)簽(EST)分析技術(shù)從3-5周齡人胚胎cDNA文庫(kù)中得到一個(gè)克隆子L30，應(yīng)用5’RACE技術(shù)，克隆了其全長(zhǎng)cDNA。經(jīng)過(guò)對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列的測(cè)定及其結(jié)構(gòu)特征的分析，證實(shí)L30為一個(gè)新的鋅指蛋白基因，國(guó)際命名委員會(huì)命名其為ZNF268。為了研究ZNF268的生物學(xué)功能，我們分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平研究了ZNF268在不同器官和組織中的表達(dá)圖譜，為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。 以~(32)P標(biāo)記的ZNF268cDNA特異片段(3’UTR)作為探針，通過(guò)Northern雜交技術(shù)，，檢測(cè)了ZNF268在42種正常人成體器官和組織以及8種晚期胎兒器官中的表達(dá)。結(jié)果顯示，除陽(yáng)性對(duì)照外，檢測(cè)的所有樣品中均無(wú)明顯的雜交信號(hào)。同時(shí)，從早期人胚胎(3-5周齡及3月齡)提取總RNA與ZNF268探針進(jìn)行雜交，均得到了3.8kb的雜交條帶。Northern結(jié)果表明ZNF268mRNA僅特異性表達(dá)于早期人胚，而在成人組織中不表達(dá)。 為了進(jìn)一步在翻譯水平研究ZNF268蛋白的表達(dá)，我們 構(gòu)建了ZNF268重組原核表達(dá)載體，純化在大腸桿菌中表達(dá) 的產(chǎn)物，制備了特異的zNF268抗體paZNF268ab。以 paZNF268ab抗體為依托，用Western印跡法檢測(cè)出在4月 齡人胚胎肝臟組織中，有分子量為108KDa的ZNF268蛋白 的特異表達(dá)信號(hào)。進(jìn)一步利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) ZNF268蛋白在5周至7月齡人胚肝中的表達(dá)。結(jié)果顯示 ZNF268蛋白在不同發(fā)育時(shí)期的人胎肝中表現(xiàn)出不同的表達(dá) 水平，其表達(dá)量隨著胚齡增加、即胚肝分化發(fā)育成熟而下 降。由此可見(jiàn)ZNF268可能參與調(diào)控早期人胚肝的分化和發(fā) 育。免疫組織化學(xué)的結(jié)果還顯示，ZNF268在早期的造血干、 祖細(xì)胞中表達(dá)。因此ZNF268也可能參與早期造血細(xì)胞的分 化發(fā)育，從而與早期人胚造血相關(guān)。 大多數(shù)鋅指蛋白做為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在細(xì)胞中的表達(dá) 集中于細(xì)胞核中。而用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ZNF268蛋白 表達(dá)產(chǎn)物的定位時(shí)，發(fā)現(xiàn)ZNF268蛋白集中于細(xì)胞質(zhì)中。為 了進(jìn)一步確認(rèn)ZNF268蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)定位，構(gòu)建了與 綠色熒光蛋白融合的部分及全長(zhǎng)ZNF268表達(dá)載體，對(duì)在 COS7細(xì)胞中表達(dá)的不同ZNF268片段融合EGFP的蛋白質(zhì)進(jìn) 行細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果證實(shí)ZNF268蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì) 胞質(zhì)中。這一結(jié)果表明ZNF268不同與大多數(shù)的鋅指蛋白， 其發(fā)揮功能可能是通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)的調(diào)控途徑。同時(shí)這一結(jié)果 為確定ZNF268的靶向物及研究ZNF268的功能奠定了基礎(chǔ)。 在研究ZNF268表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)定位時(shí)，我們還觀察 到ZNF268KRAB盒的表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核中。CZHZ型鋅指 蛋白的KRAB盒具有和其它因子相互作用而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制 的功能。ZNF268的KRAB盒保守性很高，可能同樣是一個(gè) 轉(zhuǎn)錄抑制因子。細(xì)胞內(nèi)定位的結(jié)果顯示ZNF268的KRAB盒 主要集中于細(xì)胞核中，這與其它轉(zhuǎn)錄抑制因子定位于細(xì)胞 核中是一致的。為了研究ZNF268KRAB盒的功能，構(gòu)建了一 系列含有ZNF268KRAB盒不同片段的真核表達(dá)載體;與含有 CAT基因的報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分析ZNF268KRAB盒的轉(zhuǎn) 錄抑制活性。結(jié)果證實(shí)ZNF268的KRAB盒確實(shí)具有轉(zhuǎn)錄抑 制作用;并且KRAB一A是一個(gè)強(qiáng)抑制子，KRAB一B對(duì)KRAB一A 有協(xié)同作用。 在確證了ZNF268有轉(zhuǎn)錄抑制功能的基礎(chǔ)上，我們希望 尋找ZNF268功能作用的靶向物。采用酵母雙雜交技術(shù)，用 ZNF268蛋白作為“誘餌”，篩選18~24周齡(約4一6月齡) 的人胚肝文庫(kù)。經(jīng)過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選、X一a一gal和X一p一gal 篩選、及體外免疫共沉淀驗(yàn)證，得到一個(gè)與ZNF268蛋白相 互作用的蛋白質(zhì)AHSG。研究表明，AHSG參與人胚肝的發(fā)育。 ZNF268蛋白與AHSG蛋白的互作說(shuō)明，ZNF268可能通過(guò)與 AHSG協(xié)同作用而參與調(diào)控人胚肝的發(fā)育。同時(shí)，AHSG不僅 僅表達(dá)于肝臟，在骨髓生血基質(zhì)中也有表達(dá)，并與多種血 液疾病相關(guān)，提示ZNF268潛在的與早期人胚造血的關(guān)系， 以及在某些特定情況下可能與某種疾病相關(guān)。 總之，本研究從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分析了ZNF268在人早 期胚胎中的表達(dá)特征;研究了ZNF268的細(xì)胞內(nèi)定位并分析 了其作用的靶向物。研究結(jié)果初步闡明了這一新的鋅指蛋 白基因在人早期胚胎中的功能。
【圖文】：

ZNF268及其多種轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)圖

翻譯編碼鋅指區(qū)。進(jìn)一步，的血樣，利用RT一PCR技術(shù)到了另一個(gè)新的ZNF268的ZNF268一e與ZNF268一b相AB一A起始的位置有44bp了開(kāi)放閱讀框的變化，可能起始翻譯編碼鋅指區(qū)不(
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R321

【共引文獻(xiàn)】

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1 唐曉彬;細(xì)菌人工染色體（BAC）介導(dǎo)的突變?nèi)甩?珠蛋白基因簇轉(zhuǎn)基因小鼠的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

2 蔡錦陽(yáng);鋅指蛋白KRAB結(jié)構(gòu)域入核及ZNF300在K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的功能探索[D];武漢大學(xué);2013年

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2 白松婷;特發(fā)性血小板減少性紫癜患兒骨髓巨核細(xì)胞GATA-1和NF-E2的研究[D];鄭州大學(xué);2003年

3 羅開(kāi)梅;人類心臟發(fā)育相關(guān)新基因的克隆及其表達(dá)研究[D];湖南師范大學(xué);2003年

4 曹磊;人類鋅指蛋白家族新基因ZNF383的克隆與功能研究[D];湖南師范大學(xué);2005年

5 歐瑩;人類鋅指蛋白新基因ZNF328的克隆與功能研究[D];湖南師范大學(xué);2005年

6 孫

本文編號(hào)：2632279