【摘要】： γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA在脊髓背角作用于兩種受體：離子型GABA_A受體和代謝型GABA_B受體(GABA_BR)。既往在脊髓背角對(duì)GABA_BR的研究表明：①GABA_BR分布于細(xì)的傷害性初級(jí)傳入纖維終末和脊髓背角神經(jīng)元；②激活這些受體抑制興奮性遞質(zhì)谷氨酸和抑制性遞質(zhì)GABA在背角內(nèi)的釋放；③由于行為學(xué)研究提示GABA_BR在脊髓水平有鎮(zhèn)痛作用，所以GABA_BR激動(dòng)劑baclofen可作為一種候選鎮(zhèn)痛藥物。但GABA_BR在脊髓背角的形態(tài)和機(jī)能研究方面，尤其是其鎮(zhèn)痛機(jī)制方面尚有諸多不明之處。存在的主要問題有：①GABA_BR在脊髓背角神經(jīng)元的精確定位；②GABA_BR是否對(duì)初級(jí)傳入終末傳遞的傷害性信息具有特異性調(diào)制作用；③GABA_BR發(fā)揮抑制作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子通道方面的機(jī)制；④GABA_BR對(duì)下行抑制系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的影響及機(jī)制等。我們運(yùn)用形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)研究方法，對(duì)上述問題開展了研究。主要結(jié)果如下： (1) 利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光鏡下觀察到GABA_BR樣免疫組化染色陽(yáng)性(GABA_BR-LI)的胞體、纖維和終末廣泛分布于脊髓背角，尤以淺層(Ⅰ、Ⅱ?qū)?內(nèi)為密集；背根神經(jīng)節(jié)(DRG)內(nèi)的大多數(shù)大、中和小型節(jié)細(xì)胞均呈GABA_BR樣免疫組化染色陽(yáng)性。電鏡下進(jìn)一步證實(shí)位于背角淺層內(nèi)的有髓(Aβ，Aδ)和無(wú)髓(C)纖維的終末均呈GABA_BR樣免疫組化染色陽(yáng)性，背角淺層內(nèi)亦能見到GABA_BR-LI胞體和樹突。上述結(jié)果說(shuō)明脊髓背角淺層和DRG內(nèi)有密集的GABA_BR-LI陽(yáng)性結(jié)構(gòu)，GABA_BR樣陽(yáng)性產(chǎn)物可分別定 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 位于脊髓背角淺層內(nèi)的突觸前和突觸后部位。另外刀RG 內(nèi)也有較多 G朋A。R｛I陽(yáng)性產(chǎn)物（論文1人 p）將神經(jīng)纖維切斷與免疫組織化學(xué)染色相結(jié)合，對(duì)脊髓背角淺層內(nèi)密集 的GABA。RLI終末的來(lái)源進(jìn)行了觀察。在脊髓胸段行半橫斷、切斷外周初級(jí) 傳入纖維以及同時(shí)行脊髓胸段半橫斷和切斷外周初級(jí)傳入纖維的情況下，均 可致同側(cè)腰髓背角淺層內(nèi)的GABABR－LI終末明顯減少，尤以同時(shí)行脊髓胸 段半橫斷和切斷外周初級(jí)傳入纖維時(shí)為著，但即使在此時(shí)，仍可見背角淺層 內(nèi)有稀疏的GABABR－LI神經(jīng)元和終末存留。說(shuō)明背角淺層內(nèi)的GABABR工1 終末分別來(lái)自外周初級(jí)傳入、脊髓以上的腦結(jié)構(gòu)和背角淺層內(nèi)的中間神經(jīng)元。 進(jìn)一步用熒光素逆行追蹤與免疫熒光組織化學(xué)染色相結(jié)合的雙標(biāo)法觀察到向 脊髓背角投射的GABABRLI神經(jīng)元主要位于同側(cè)的延髓吻段腹側(cè)部（RVM）、 延髓中縫核團(tuán)和中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）。由于PAG、RVM和延髓中縫 核團(tuán)是調(diào)控脊髓背角內(nèi)傷害性信息傳遞的下行抑制系統(tǒng)的主要組成部分，上 述結(jié)果提示GABABR可能參與對(duì)中樞內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的調(diào)控（論文2人 O）改進(jìn)了制作可帶背根的成年大鼠脊髓薄片的方法。利用盲插全細(xì)胞電 壓鉗記錄技術(shù)，在脊髓薄片上可以借助記錄和分析突觸后電流等途徑研究突 觸傳遞的機(jī)理（論文3）。 K）在脊髓薄片標(biāo)本上，利用全細(xì)胞電壓鉗技術(shù)觀察到GABA。R激動(dòng)劑 baclofen在背角膠狀質(zhì)pG）神經(jīng)元引起一個(gè)緩慢的外向（抑制性）電流；用 G蛋白抑制劑或 K＋通道阻斷劑分別抑制或阻斷位于突觸后的 G蛋白偶聯(lián)受 體或 K＋通道后，此緩慢外向電流消失。提示該抑制性電流是由 baclofen作用 于突觸后的G蛋白偶聯(lián)受體引起的（論文4）。baclofen還可作用于突觸前終 末上的 GABABR，抑制刺激粗（A刊和細(xì)（C，AS）初級(jí)傳入纖維引起的單 突觸興奮性突觸電流（EPSCS人提示激活位于突觸前的 GABABR可抑制興奮 性遞質(zhì)的釋放。上述結(jié)果不但與我們的形態(tài)學(xué)結(jié)論一致，而且表明GABABR 5 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 在脊髓背角神經(jīng)元的突觸前、突觸后均可發(fā)揮抑制作用（論文＊。baclofen 還抑制刺激背根引起的抑制性突觸后電流（IPSCs），此結(jié)果進(jìn)一步提示位于 脊髓背角的GABABR通過影響抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而參與初級(jí)感覺信息的 調(diào)制（論文4）。 刺激SG神經(jīng)元引起的神經(jīng)遞質(zhì)釋放依賴于細(xì)胞外CaZ”的存在和（或） 動(dòng)作電位，但GABABR通過何種機(jī)制調(diào)控遞質(zhì)的自發(fā)釋放尚不清楚。己知 baclofen作用于突觸前的GABA。R，能夠抑制突觸前終末遞質(zhì)自發(fā)釋放。我 們進(jìn)一步的研究表明在無(wú)＊“或義電導(dǎo)被阻滯條件下，此抑制作用依然存 在。提示baclofen的抑制作用與突觸前的＊”或K＋通道均無(wú)關(guān)。以forskolin 持續(xù)激活腺苦酸環(huán)化酶或用NEM將G蛋白偶聯(lián)受體損毀，均可阻斷baclofen 的突觸前抑制作用：而PKC�；顒㏄DBll則無(wú)阻斷作用。上述結(jié)果提示 baclofen通過與突觸前的G蛋白偶聯(lián)受體和（或）cAMP途徑遞質(zhì)自發(fā)釋放， 而與PKC無(wú)關(guān)（論文5）。 ＊）利用全細(xì)胞電壓鉗方法研究了GABAsR激動(dòng)劑baclofen對(duì)中腦導(dǎo)水 管周圍灰質(zhì)（PAG）腹外側(cè)區(qū)神經(jīng)元活動(dòng)的影響。激活PAG腹外側(cè)區(qū)內(nèi)的 GABABR引起神經(jīng)元超極化；用 G蛋白抑制劑或 K＋通道阻斷劑分別抑制或 阻斷位于突觸后的G蛋白或礦通道后，，該超極化電流減小或消失。提示該 電流是激活位于突觸后
【圖文】：

2、全細(xì)胞記錄標(biāo)本置于灌流槽內(nèi)，通過下部的投射光，解剖顯微鏡下可見SG呈半透明狀，可很容易地與相鄰層次區(qū)分(圖1一2)。形成膜片鉗記錄的封接方法與同傳統(tǒng)方法相同I’l:用微操縱儀操縱記錄電極尖端接近、但不接觸標(biāo)本的sG的表面。通過一個(gè)玻璃注射器(總?cè)萘?0ml)從后部給電極內(nèi)加正壓，以防止電極尖端在脊髓組織內(nèi)被堵塞。調(diào)整好放大器并施予方波刺激，在示波器上可以看到矩形方波。以微操縱儀緩慢推進(jìn)電極，同時(shí)通過示波器監(jiān)視波形的變化。當(dāng)電極尖端接近一個(gè)神經(jīng)元胞體時(shí)，由于電阻增大，矩形方波幅度減小。此時(shí)將注射器正壓釋放并轉(zhuǎn)為負(fù)壓吸引即可形成封接。等待約1min，待封接完全形成，再適當(dāng)加大負(fù)壓，直至細(xì)胞膜被抽破。此時(shí)可在示波器上見到神經(jīng)元特有的電容特征波形，即可判定形成封接的是神經(jīng)元。解除刺激方波。在鉗制電壓為一70mV時(shí)

4床敘盜.尸一習(xí)’0OP“圖1一3在薄片標(biāo)本上記錄到的各種突觸電流(A)鉗制電壓為一70mV時(shí)記錄到自發(fā)的興奮性突觸后電流(EPSCs)。(B)刺激背根可以記錄到不同纖維激活引起的eEPSCs。根據(jù)傳導(dǎo)速度和刺激強(qiáng)度可以判斷纖維的類型。箭頭指示刺激偽跡，三角指示A6纖維介導(dǎo)的反應(yīng)，雙三角指示C纖維介導(dǎo)的反應(yīng)。(C)鉗制電壓為0mV時(shí)可以記錄到自發(fā)的抑制性突觸后電流(IPSCs)(上):刺激背根可以記錄到刺激引起的eIPSCs(下)。田)和(C)中，箭頭指示刺激尾跡，三角指示刺激引起的突觸電流。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2630412