【摘要】： γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA在脊髓背角作用于兩種受體：離子型GABA_A受體和代謝型GABA_B受體(GABA_BR)。既往在脊髓背角對GABA_BR的研究表明：①GABA_BR分布于細的傷害性初級傳入纖維終末和脊髓背角神經(jīng)元；②激活這些受體抑制興奮性遞質(zhì)谷氨酸和抑制性遞質(zhì)GABA在背角內(nèi)的釋放；③由于行為學(xué)研究提示GABA_BR在脊髓水平有鎮(zhèn)痛作用，所以GABA_BR激動劑baclofen可作為一種候選鎮(zhèn)痛藥物。但GABA_BR在脊髓背角的形態(tài)和機能研究方面，尤其是其鎮(zhèn)痛機制方面尚有諸多不明之處。存在的主要問題有：①GABA_BR在脊髓背角神經(jīng)元的精確定位；②GABA_BR是否對初級傳入終末傳遞的傷害性信息具有特異性調(diào)制作用；③GABA_BR發(fā)揮抑制作用的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子通道方面的機制；④GABA_BR對下行抑制系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的影響及機制等。我們運用形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)研究方法，對上述問題開展了研究。主要結(jié)果如下： (1) 利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光鏡下觀察到GABA_BR樣免疫組化染色陽性(GABA_BR-LI)的胞體、纖維和終末廣泛分布于脊髓背角，尤以淺層(Ⅰ、Ⅱ?qū)?內(nèi)為密集；背根神經(jīng)節(jié)(DRG)內(nèi)的大多數(shù)大、中和小型節(jié)細胞均呈GABA_BR樣免疫組化染色陽性。電鏡下進一步證實位于背角淺層內(nèi)的有髓(Aβ，Aδ)和無髓(C)纖維的終末均呈GABA_BR樣免疫組化染色陽性，背角淺層內(nèi)亦能見到GABA_BR-LI胞體和樹突。上述結(jié)果說明脊髓背角淺層和DRG內(nèi)有密集的GABA_BR-LI陽性結(jié)構(gòu)，GABA_BR樣陽性產(chǎn)物可分別定 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 位于脊髓背角淺層內(nèi)的突觸前和突觸后部位。另外刀RG 內(nèi)也有較多 G朋A。R｛I陽性產(chǎn)物（論文1人 p）將神經(jīng)纖維切斷與免疫組織化學(xué)染色相結(jié)合，對脊髓背角淺層內(nèi)密集 的GABA。RLI終末的來源進行了觀察。在脊髓胸段行半橫斷、切斷外周初級 傳入纖維以及同時行脊髓胸段半橫斷和切斷外周初級傳入纖維的情況下，均 可致同側(cè)腰髓背角淺層內(nèi)的GABABR－LI終末明顯減少，尤以同時行脊髓胸 段半橫斷和切斷外周初級傳入纖維時為著，但即使在此時，仍可見背角淺層 內(nèi)有稀疏的GABABR－LI神經(jīng)元和終末存留。說明背角淺層內(nèi)的GABABR工1 終末分別來自外周初級傳入、脊髓以上的腦結(jié)構(gòu)和背角淺層內(nèi)的中間神經(jīng)元。 進一步用熒光素逆行追蹤與免疫熒光組織化學(xué)染色相結(jié)合的雙標法觀察到向 脊髓背角投射的GABABRLI神經(jīng)元主要位于同側(cè)的延髓吻段腹側(cè)部（RVM）、 延髓中縫核團和中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）。由于PAG、RVM和延髓中縫 核團是調(diào)控脊髓背角內(nèi)傷害性信息傳遞的下行抑制系統(tǒng)的主要組成部分，上 述結(jié)果提示GABABR可能參與對中樞內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的調(diào)控（論文2人 O）改進了制作可帶背根的成年大鼠脊髓薄片的方法。利用盲插全細胞電 壓鉗記錄技術(shù)，在脊髓薄片上可以借助記錄和分析突觸后電流等途徑研究突 觸傳遞的機理（論文3）。 K）在脊髓薄片標本上，利用全細胞電壓鉗技術(shù)觀察到GABA。R激動劑 baclofen在背角膠狀質(zhì)pG）神經(jīng)元引起一個緩慢的外向（抑制性）電流；用 G蛋白抑制劑或 K＋通道阻斷劑分別抑制或阻斷位于突觸后的 G蛋白偶聯(lián)受 體或 K＋通道后，此緩慢外向電流消失。提示該抑制性電流是由 baclofen作用 于突觸后的G蛋白偶聯(lián)受體引起的（論文4）。baclofen還可作用于突觸前終 末上的 GABABR，抑制刺激粗（A刊和細（C，AS）初級傳入纖維引起的單 突觸興奮性突觸電流（EPSCS人提示激活位于突觸前的 GABABR可抑制興奮 性遞質(zhì)的釋放。上述結(jié)果不但與我們的形態(tài)學(xué)結(jié)論一致，而且表明GABABR 5 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 在脊髓背角神經(jīng)元的突觸前、突觸后均可發(fā)揮抑制作用（論文＊。baclofen 還抑制刺激背根引起的抑制性突觸后電流（IPSCs），此結(jié)果進一步提示位于 脊髓背角的GABABR通過影響抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而參與初級感覺信息的 調(diào)制（論文4）。 刺激SG神經(jīng)元引起的神經(jīng)遞質(zhì)釋放依賴于細胞外CaZ”的存在和（或） 動作電位，但GABABR通過何種機制調(diào)控遞質(zhì)的自發(fā)釋放尚不清楚。己知 baclofen作用于突觸前的GABA。R，能夠抑制突觸前終末遞質(zhì)自發(fā)釋放。我 們進一步的研究表明在無＊“或義電導(dǎo)被阻滯條件下，此抑制作用依然存 在。提示baclofen的抑制作用與突觸前的＊”或K＋通道均無關(guān)。以forskolin 持續(xù)激活腺苦酸環(huán)化酶或用NEM將G蛋白偶聯(lián)受體損毀，均可阻斷baclofen 的突觸前抑制作用：而PKC�；顒㏄DBll則無阻斷作用。上述結(jié)果提示 baclofen通過與突觸前的G蛋白偶聯(lián)受體和（或）cAMP途徑遞質(zhì)自發(fā)釋放， 而與PKC無關(guān)（論文5）。 ＊）利用全細胞電壓鉗方法研究了GABAsR激動劑baclofen對中腦導(dǎo)水 管周圍灰質(zhì)（PAG）腹外側(cè)區(qū)神經(jīng)元活動的影響。激活PAG腹外側(cè)區(qū)內(nèi)的 GABABR引起神經(jīng)元超極化；用 G蛋白抑制劑或 K＋通道阻斷劑分別抑制或 阻斷位于突觸后的G蛋白或礦通道后，，該超極化電流減小或消失。提示該 電流是激活位于突觸后
【圖文】：

2、全細胞記錄標本置于灌流槽內(nèi)，通過下部的投射光，解剖顯微鏡下可見SG呈半透明狀，可很容易地與相鄰層次區(qū)分(圖1一2)。形成膜片鉗記錄的封接方法與同傳統(tǒng)方法相同I’l:用微操縱儀操縱記錄電極尖端接近、但不接觸標本的sG的表面。通過一個玻璃注射器(總?cè)萘?0ml)從后部給電極內(nèi)加正壓，以防止電極尖端在脊髓組織內(nèi)被堵塞。調(diào)整好放大器并施予方波刺激，在示波器上可以看到矩形方波。以微操縱儀緩慢推進電極，同時通過示波器監(jiān)視波形的變化。當電極尖端接近一個神經(jīng)元胞體時，由于電阻增大，矩形方波幅度減小。此時將注射器正壓釋放并轉(zhuǎn)為負壓吸引即可形成封接。等待約1min，待封接完全形成，再適當加大負壓，直至細胞膜被抽破。此時可在示波器上見到神經(jīng)元特有的電容特征波形，即可判定形成封接的是神經(jīng)元。解除刺激方波。在鉗制電壓為一70mV時

4床敘盜.尸一習(xí)’0OP“圖1一3在薄片標本上記錄到的各種突觸電流(A)鉗制電壓為一70mV時記錄到自發(fā)的興奮性突觸后電流(EPSCs)。(B)刺激背根可以記錄到不同纖維激活引起的eEPSCs。根據(jù)傳導(dǎo)速度和刺激強度可以判斷纖維的類型。箭頭指示刺激偽跡，三角指示A6纖維介導(dǎo)的反應(yīng)，雙三角指示C纖維介導(dǎo)的反應(yīng)。(C)鉗制電壓為0mV時可以記錄到自發(fā)的抑制性突觸后電流(IPSCs)(上):刺激背根可以記錄到刺激引起的eIPSCs(下)。田)和(C)中，箭頭指示刺激尾跡，三角指示刺激引起的突觸電流。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R329

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本文編號：2630412