【摘要】： 本論文研究的目的是利用轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)，獲得能正確表達(dá)霍亂腸毒素 B亞單位（CTB）的番茄，并希望制成在生食后能刺激粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù) 性抗體的疫苗。目前許多先進(jìn)國(guó)家的研究機(jī)構(gòu)及工業(yè)界，積極研究開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因 植物作為生物反應(yīng)器，欲取代傳統(tǒng)的微生物及酵母發(fā)酵系統(tǒng)，來(lái)生產(chǎn)具有高價(jià) 值的醫(yī)用蛋白質(zhì)。此外，利用植物種子生產(chǎn)的外源基因工程蛋白質(zhì)的品質(zhì)相當(dāng) 穩(wěn)定，可降低儲(chǔ)藏及運(yùn)輸?shù)馁M(fèi)用。在某些用途下，例如作為飼料添加劑，或食 品及釀酒的原料，或口服疫苗等，若含有外源蛋白質(zhì)的組織可直接食用的話， 則不需要經(jīng)過(guò)高成本的純化過(guò)程；為了利用植物系統(tǒng)表達(dá)細(xì)菌抗原蛋白，希望 制成可食用的蔬果疫苗用于預(yù)防感染性腹瀉病。選用番茄作為表達(dá)系統(tǒng)是因?yàn)?它是世界上最重要的果蔬之一，具有營(yíng)養(yǎng)成分豐富，適口性強(qiáng)，生、熟食均可 的特點(diǎn)，且它的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相對(duì)較為成熟，為此，我們?cè)O(shè)計(jì)將霍亂腸毒素B 亞單位（CT-B）基因轉(zhuǎn)入番茄（L.esculentum,金豐一號(hào)）中表達(dá)，通過(guò)大量預(yù)試 驗(yàn)建立了有效的番茄外源基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并成功將CT-B基因轉(zhuǎn)入番茄細(xì)胞 中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，ELISA檢測(cè)和Western雜交試驗(yàn)的結(jié)果表明CT-B基 因在番茄中獲得表達(dá)。 首先利用高保真PCR、分子克隆、計(jì)算機(jī)分析和序列分析等方法構(gòu)建了2 個(gè)中間載體（pRCTB、pRCTBK）和4個(gè)植物雙元表達(dá)載體（pGA-CTB、 pGA-CTBK、pBI_CTB、pBI-CTBK），其中pRCTBK、pGA-CTBK、pBI-CTBK 載體的CT-B基因的3'加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引導(dǎo)序列SEKDEL，均以CaMV35S為啟動(dòng) 子，NOS終止子，并將其中2個(gè)植物表達(dá)載體（pBI-CTB和pBI-CTBK）通 過(guò)電轉(zhuǎn)化法直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。 高效的再生及轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是外源目的基因?qū)胫参锏那疤�，本研究采用葉盤 法，需要考慮外植體的來(lái)源及種類、供體菌株、培養(yǎng)篩選條件等因素。在對(duì)番 茄的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：1）對(duì)于番茄離體子葉培養(yǎng)，單加細(xì)胞分裂素（玉 米素ZT或6-芐氨基嘌呤BA）對(duì)不定芽的分化均有效，但ZT的效果更好，ZT 彭志強(qiáng) 博士論文：霍亂腸毒素 B亞單位在番茄植物中表達(dá)的研究 不僅能提研葉的再生頻率，也s蹦加分化的牙數(shù)。2）加入少量生長(zhǎng)素后， 對(duì)不定芽的分化有明顯的抑制作用。3）適宜于鵬體組織培養(yǎng)的外植體并不 一定適宜于做轉(zhuǎn)基因受體jZE）ytl＆的多地｝植體中，，以二o子葉處切害仔喻 產(chǎn)生吸K動(dòng)本用作轉(zhuǎn)化受體最好。4歸瀕同頓統(tǒng)以MSO為基坷時(shí)柒帛基，附 加 ZTI．h嗎幾和 IAA．2叫嚇 10—13天酗的子咐敝，娜再生頻率 達(dá)97．5％，每葉吵植體平均再姐敝39個(gè)。5）番茄子葉的高頻轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 是以高頻再生系統(tǒng)為基礎(chǔ)，子葉預(yù)培養(yǎng)2天，根癌農(nóng)桿菌侵染30州，暗處 AIA＋g 2 M，A：muurnllHt85EjjgxHHHIMstKx，）B＝um．l－－－… 化出芽。句探索了最佳的選擇壓強(qiáng)度和砌p時(shí)間即p霉素濃度為扣叫札， ————，％——。 對(duì)I3 ＄M：1！EfnskrelW－因組DNA，顆PCR和Southrm A4qiKi的方 法，證實(shí)10株顯示CTB基因整治侄幡濃隆因組DNA中。 提取含 q和 pBICIBK Mh隨因翻刪片的總的可 靴蛋白，進(jìn)行ELISA柵仰WH雜交，娥表明C7J3在番茄植物中 得到正確表達(dá)，表達(dá)量達(dá) 30ugh葉片和 4flirt葉片，含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引導(dǎo)序列 SEKDEL的植物表達(dá)載體表達(dá)量略高。至此，洲門得到了表達(dá)霍亂腸毒素B 亞單位的番茄植株。 對(duì)植物表達(dá)扶原基因CTS的應(yīng)用前景及在植物中表達(dá)所存在的問(wèn)題進(jìn)行 了詳細(xì)的討論。番茄中的表達(dá)量相對(duì)較低，我什認(rèn)為其原因是多方面的，雖然 二者的表達(dá)系絞鉚屬于植物，但由于所采用的種或品種的不同，表達(dá)量存在差 異是可以預(yù)見(jiàn)的；另外也可腳困娜1的純化技術(shù)有關(guān)，從植物中提取的粗蛋白 可sggjt＆ffl；5＋的0七或者使部分CPS發(fā)生了降解。當(dāng)然，不同植物表達(dá) 載體的應(yīng)用以及各種調(diào)控D啟動(dòng)子，增強(qiáng)子的不同，也膨）源蛋白的表達(dá) 量出現(xiàn)差異，這在目前尚無(wú)一致的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步力0強(qiáng)對(duì)各表紋羹系統(tǒng)分子生物學(xué) 基礎(chǔ)研究是必段的。將其它抗原基因與CTS基因同時(shí)構(gòu)建到植物表達(dá)載體 — —－時(shí) 中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的基因表達(dá)、產(chǎn)物的免疫原性和Iftipe．－xxxu－－的進(jìn)一步研究， 有可敝喊免疫效果更好的可食用蔬果疫苗，從而渡愧階、使用方便、安全 有效的目的。 在試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)一些分于生物學(xué)試驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)，如提高PCR產(chǎn) 物亞克隆效率方活根癌農(nóng)桿茵中重組質(zhì)粒的提取及酶切證實(shí)方法的改進(jìn)。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R378.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉玉樂(lè),王晉芳,邱并生,趙淑珍,田波;人乙肝病毒表面抗原基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)[J];中國(guó)科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1993年03期

2 李寶健,王金發(fā),徐增富,許友卿,余慕貞,何新,沈玉;人生長(zhǎng)激素基因在花葉芋中的整合與表達(dá)[J];中國(guó)科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1993年04期

3 施蘇華，章群，陳月琴，唐紹清，屈良鵠;一種簡(jiǎn)易的植物核酸提取方法─—從干葉和新鮮葉中快速提取RNA和DNA[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1996年02期

本文編號(hào)：2630165