【摘要】：天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防線,也是激活適應(yīng)性免疫的基礎(chǔ),在宿主清除病毒的免疫反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用,因此成為當(dāng)前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。天然免疫應(yīng)答就是病原微生物感染機(jī)體后,首先通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptor, PRR)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP),從而激活一系列信號(hào)通路,誘導(dǎo)包括IRF3和NF-κ B在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子的活化入核,協(xié)同促進(jìn)Ⅰ型干擾素、炎癥因子等多種細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。Ⅰ型干擾素通過(guò)與細(xì)胞膜上的干擾素受體相互作用,誘導(dǎo)一系列抗病毒蛋白的表達(dá),這些抗病毒蛋白協(xié)同作用,通過(guò)抑制病毒復(fù)制或誘導(dǎo)被感染細(xì)胞的凋亡,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。炎癥因子所引發(fā)的炎癥反應(yīng)能夠激活天然免疫細(xì)胞,并誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。由此可見(jiàn),Ⅰ型干擾素等細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)具有至關(guān)重要的作用。而在眾多信號(hào)通路中以Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和維甲酸誘導(dǎo)的基因Ⅰ樣受體(Retinoic acid-induced gene I like receptors, RLRs)所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最為熱點(diǎn)。 E3泛素連接酶(E3ubiquitin ligase)是一種具有調(diào)節(jié)目的蛋白泛素化水平的分子,通常以K48偶聯(lián)的泛索化方式促進(jìn)目的蛋白通過(guò)蛋白酶體系統(tǒng)降解,或者通過(guò)K63偶聯(lián)的泛素化促進(jìn)目的蛋白的活化。目前已有報(bào)道顯示E3可以通過(guò)調(diào)節(jié)TLR和RLR通路中的多個(gè)信號(hào)分子的降解或者活化從而調(diào)節(jié)并平衡免疫應(yīng)答。如TRIM30a、TRIM21、Triad3A、A20、 RNF5、RNF125、AIP4以及PSMA等可通過(guò)K48泛素化形式降解相應(yīng)接頭蛋白,進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)通路。關(guān)于E3連接酶如何參與到抗病毒的信號(hào)通路中已成為當(dāng)今科學(xué)研究領(lǐng)域中的重要話題。 一.研究目的： 前期研究發(fā)現(xiàn)TRIP(TRAF-interacting Protein)在TNF-α介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用,并認(rèn)為T(mén)RIP通過(guò)阻斷TNFR與TRAF2的結(jié)合的方式負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)通路：又有報(bào)道稱TRIP具有體外泛素化功能,但關(guān)于其靶點(diǎn)卻沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。因此TRIP是否參與到TLR和RLR所介導(dǎo)的I型干擾索的產(chǎn)生過(guò)程中,并且是否通過(guò)其泛素化功能起到相應(yīng)作用都不得而知。 二.研究方法： 1.TLR信號(hào)通路對(duì)TRIP的調(diào)控 1.1TLR對(duì)TRIP的表達(dá)影響 用TLR4的配體LPS刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，在刺激的不同時(shí)間點(diǎn)收獲RNA和蛋白，利用RT-PCR及Western Blotting方法,檢測(cè)LPS刺激后TRIP在RNA水平和蛋白水平上的變化。 1.2TRIP在細(xì)胞內(nèi)的定位 將TRIP構(gòu)建到含F(xiàn)LAG標(biāo)簽和GFP標(biāo)簽的表達(dá)載體上,將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HBK293,利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)TRIP在細(xì)胞內(nèi)的定位。 1.3TLR對(duì)TRIP細(xì)胞內(nèi)定位的影響 用TLR4的配體LPS刺激巨噬細(xì)胞系RAW264.7,在不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞。將細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白分別提取，利用Western Blotting方法，檢測(cè)LPS刺激后TRIP在細(xì)胞內(nèi)的定位是否發(fā)生變化。 2TRIP負(fù)向調(diào)控TLR及RLR介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生 2.1TRIP對(duì)TLR3/4介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的的影響 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾,或者將TRIP超表達(dá)質(zhì)料轉(zhuǎn)染HEK293-TLR3細(xì)胞系,用TLR3的配體Poly (I:C)和TLR4的配體LPS分別刺激細(xì)胞，利用RT-PCR, I-LISA及報(bào)告基因方法檢測(cè)IFN-β的mRNA(?)水平，分泌水平及報(bào)告基因活性水平的變化，探討TRIP對(duì)介導(dǎo)的信號(hào)信號(hào)通路的影響。 2.2TRIP對(duì)RIG-I介導(dǎo)的IFN-P產(chǎn)生的的影響 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾，或者TRIP超表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系,用Sev感染細(xì)胞系或者Poly (I:C)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,活化RIG-I信號(hào)通路,分別用RT-PCR, ELISA和報(bào)告基因方法檢測(cè)IFN-β的mRNA水平,分泌水平及報(bào)告基因活性水平的變化,探討TRIP對(duì)RLR介導(dǎo)的信號(hào)信號(hào)通路的影響。 3TRIP調(diào)控IFN-β表達(dá)的分子機(jī)制 3.1TRIP對(duì)轉(zhuǎn)錄因子IRF3活性的影響 將TRIP超表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系,再用Sev感染細(xì)胞系或者poly(I：C)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,檢測(cè)IRF3的磷酸化,二聚化以及報(bào)告基因活性的變化,探討TRIP過(guò)表達(dá)后對(duì)RLR介導(dǎo)的IRF3活化的影響。 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾,用TLR3的配體Poly (I:C)和TLR4的配體LPS分別刺激,利用Western Blotting方法,檢測(cè)TRIP干擾后對(duì)LPS及Poly (I:C)介導(dǎo)的IRF3活化的影響。 3.2TRIP靶點(diǎn)的尋找 將TLR,RLR信號(hào)通路中的TRIF,RIG-I,MDA5, MAVS,TBK1.IRF3等接頭蛋白表達(dá)載體與TRIP過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293,利用RT-PCR及報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)TRIP對(duì)不同接頭蛋白所介導(dǎo)的IFNβ m RNA表達(dá)及報(bào)告基因活性的影響。 3.3TRIP對(duì)接頭蛋白的降解 篩選高表達(dá)TRIP的RAW264.7穩(wěn)定細(xì)胞株或者用干擾RNA將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾,用LPS刺激細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn),收獲蛋白,用TRAF3, TRAF6, IRF3, STAT1等特異性抗體做VVestern Blotting,探究TRIP對(duì)各個(gè)接頭蛋白內(nèi)源性表達(dá)量的影響。 將TLR,RLR信號(hào)通路中TRAF3,TBK1,IRF3等接頭蛋白的表達(dá)載體與TRIP的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293, Western Blotting的力’法探究TRIP對(duì)各個(gè)接頭蛋白的表達(dá)量影響,并加入蛋白酶體抑制劑MG132,觀察TRIP內(nèi)降解作用是否消失。 3.4TRIP對(duì)接頭蛋白的泛素化 將TRIP表達(dá)載體,接頭蛋白表達(dá)載體與泛素表達(dá)載體一同轉(zhuǎn)染HEK293,加入蛋白酶體抑制劑MG132,用接頭蛋白抗體做免疫共沉淀,用泛素抗體進(jìn)行Western Blotting,探討TRIP是否對(duì)接頭蛋白進(jìn)行泛素化。 將TRIP表達(dá)載體,接頭蛋白表達(dá)載體與野生型泛素表達(dá)載體,K48位點(diǎn)突變泛素表達(dá)載體,K63位點(diǎn)突變泛素表達(dá)載體一同轉(zhuǎn)染HEK293,用接頭蛋白對(duì)應(yīng)抗體做免疫共沉淀,用泛素標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western Blotting,探討TRIP(?)時(shí)接頭蛋白的泛素化形式。 4TRIP抵抗病毒的生理意義 4.1TRIP對(duì)病毒介導(dǎo)的IFN-β的影響 將TRIP超表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系,用Sev感染細(xì)胞,使用RT-PCR, ELISA技術(shù)檢測(cè)TRIP對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響；報(bào)告基因檢測(cè)TRIP對(duì)IFN-β, IRF3活性的影響；Western Blotting檢測(cè)TRIP對(duì)IRF3二聚化的影響,及對(duì)接頭蛋白降解的影響。 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾,用Sev感染細(xì)胞，重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn),探究干擾TRIP后是否具有相反的作用 4.2TRIP對(duì)病毒增殖復(fù)制影響 將TRIP超農(nóng)達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系,24小時(shí)后轉(zhuǎn)染Poly(I:C),靜置培養(yǎng)6小時(shí)并加入VSV,第二天收集上清及細(xì)胞mRNA,利用病毒空斑實(shí)驗(yàn)及RT-PCR技術(shù),檢測(cè)病毒的數(shù)量。 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾，重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn)，探究干擾TRIP后是否具有相反的作用。 三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1. TLR信號(hào)通路對(duì)TRIP的調(diào)控 1.1TLR促進(jìn)TRIP的表達(dá) 我們?yōu)樘接慣RIP是否參與TLR信號(hào)通路中，首先用TLR4的配體LPS刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR及Western Blotting方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),從LPS刺激4小時(shí)開(kāi)始，TRIP的表達(dá)量逐漸增加，在12到16小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰LPS刺激24小時(shí)后TRIP的水平又有所恢復(fù)，用TLR3的配體Poly(I:C)(?)激或者RIG-(?)的配體Scv感染細(xì)胞后，TRIP的表達(dá)量也發(fā)生用樣的變化。這說(shuō)明TRIP有可能參與到TLR及RLR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中。 1.2TRIP主要定位于細(xì)胞漿 由于很多文獻(xiàn)報(bào)道的TRIP的定位差距較大,有人認(rèn)為T(mén)RIP分布在胞核,有人認(rèn)為T(mén)RIP在胞質(zhì),TRIP的定位對(duì)于其之后的功能研究而言至關(guān)重要，因此我們通過(guò)免疫熒光的方法檢測(cè)TRIP的細(xì)胞定位,用FLAG-TRIP轉(zhuǎn)染HEK293,24小時(shí)后,進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),用抗FLAG的熒光二抗孵育細(xì)胞,在488nm波長(zhǎng)激發(fā)光下觀察,發(fā)現(xiàn)TRIP即分布在胞核又分布在胞漿,且在胞漿的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在胞核中的量,另外我們觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象,即TRIP在胞漿中成散點(diǎn)狀分布,這與TBK1的分布極其相似,這也為之后的靶點(diǎn)尋找提供了一個(gè)依據(jù)。另外我們構(gòu)建了GFP標(biāo)簽的TRIP表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞系中,直接用熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)相同現(xiàn)象。 1.3TLR不影響TRIP在細(xì)胞內(nèi)定位 將RAW264.7鋪小平皿，靜置培養(yǎng)16-24h, LPS或Poly (i:c)刺激30min,60min,提取細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白,調(diào)節(jié)濃度后進(jìn)行Western Blotting,結(jié)果顯示LPS或Poly(I:C)刺激細(xì)胞后,RAW264.7細(xì)胞中TRIP并沒(méi)有出現(xiàn)出核或入核情況。由于TRIP主要位于細(xì)胞漿中,且刺激后沒(méi)有發(fā)生明顯入核,說(shuō)明TRIP可能主要作用于胞漿蛋白。 2. TRIP負(fù)向調(diào)控TLR及RLR介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生 2.1TRIP抑制TLR3/4介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生 為進(jìn)一步驗(yàn)證TRIP是否參與到TLR3/4介導(dǎo)的IFN-β的影響,我們構(gòu)建了TRIP的表達(dá)載體,并在公司合成了小鼠TRIP的干擾RNA。在HEK293細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染TRIP的表達(dá)載體,進(jìn)行Vestern Blotting,用相應(yīng)標(biāo)簽(FLAG,Myc)抗體孵育,發(fā)現(xiàn)TRIP表達(dá)良好。用淀粉誘導(dǎo)C57小鼠的巨噬細(xì)胞,轉(zhuǎn)染TRIP的干擾RNA,進(jìn)行Western Blotting,用TRIP特異性抗體孵育,發(fā)現(xiàn)TRIP干擾RNA的干擾效率很高。將TRIP干擾后的小鼠巨噬細(xì)胞用LPS, Poly(I:C)刺激細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR及ELISA分別檢測(cè)IFN-β的mRNA水平及分泌水平的變化,結(jié)果顯示,進(jìn)行干擾TRIP后,LPS, Poly(I:C)刺激的IFN-β的mRNA水平及分泌水平都出現(xiàn)明顯升高，這預(yù)示著TRIP可以負(fù)向調(diào)控TLR3/4介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。 為驗(yàn)證超表達(dá)TRIP后對(duì)TLR通路介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生是否有相反的效果,由于HEK293沒(méi)有TLR,因此我們選用了293-TLR3細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染TRIP表達(dá)質(zhì)粒24h,加Poly(I:C)刺激,即刻活化TLR3信號(hào)通路,用時(shí)轉(zhuǎn)染IFN-β告基因,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)的TRIP會(huì)抑制IFN-β的報(bào)告基因活性。 2.2TRIP抑制RIG-I介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生 用Poly (I:C)轉(zhuǎn)染HEK293的方法可以模擬活化RIG-I信號(hào)通路,因此我們?cè)贖EK293中轉(zhuǎn)染TRIP超表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)TRIP會(huì)抑制轉(zhuǎn)染Poly (I:C)所介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。RAW264.7(?)胞系瞬時(shí)轉(zhuǎn)染i NOS, GAS(?)報(bào)告基因，用IFN-γ刺激細(xì)胞,活化IFN信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的TRIP對(duì)IFN-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路沒(méi)有影響,這也說(shuō)明了TRIP對(duì)TLR和RLR信號(hào)通路的影響具有一定的特異性。 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾,用Sev感染細(xì)胞,活化RIG-1信號(hào)通路,分別用RT-PCR, ELISA用報(bào)告基因方法檢測(cè)IFN-β的m RNA水平,分泌水平及報(bào)告基因活性水平的變化。結(jié)果顯示干擾TRIP后，Sev介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生量明顯升高。 3. TRIP調(diào)控IFN-β的分子機(jī)制 3.1TRIP負(fù)向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子IRF3活性 IRF3足TLR,RLR活化產(chǎn)生IFN-3的最重要的轉(zhuǎn)錄因子,所以我們想探討TRIP會(huì)不會(huì)影響IRF3的活性,進(jìn)而影響IFN-β的產(chǎn)生。首先利用報(bào)告基因技術(shù),將IRF3的報(bào)告基因與TPIR超表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RAW264.7,用LPS,Poly(I:C)刺激消化TLR3/TLR4信號(hào)通路,或者將IRF3報(bào)告基因與TRIP超表達(dá)共轉(zhuǎn)染HEK293,然后的轉(zhuǎn)染Poly (I:C)的方法活化RIG-I信與通路,發(fā)現(xiàn)TRIP會(huì)抑制TLR及RLR之介導(dǎo)的IRF3報(bào)告基因活性。將RIG-I,MAVS及TBK1的超表達(dá)載體與IRF3報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染HEK293,活化IRF3報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)的TRIP會(huì)抑制IRF3的報(bào)告基因活性，這一方面說(shuō)明IRIP會(huì)負(fù)向調(diào)控RLR介導(dǎo)的IRF3活性，另一方面說(shuō)明，TRIP的作用靶點(diǎn)在TBK1或者更下游位置。 進(jìn)而我們想探討TRIP會(huì)不會(huì)影響IRF3磷酸化情況，首先我們轉(zhuǎn)染TRIP超表達(dá)質(zhì)粒HEK293中，然后轉(zhuǎn)染Poly (I:C活化RLR信號(hào)通路，檢測(cè)蛋白磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)TRIP可以降低RLR信號(hào)通路介導(dǎo)的IRF3磷酸化水平。將TRIP干擾RNA轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，36小時(shí)后，用Poly (I:C刺激細(xì)胞，觀察磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)干擾TRIP后TLR3介導(dǎo)的IRF3磷酸化水平明顯升高。 3.2TRIP的作用靶點(diǎn)為T(mén)BK1 為了確定TRIP在TLR及RLR信號(hào)通路中的作用靶點(diǎn)，我們將RIG-I-,MAVS-, TBK1-, TRIF-及MDA5的表達(dá)載體與TRIP的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293,通過(guò)RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRIP負(fù)向調(diào)控這些接頭蛋白介導(dǎo)的IFN-β的mRNA表達(dá)水平。同樣將RIG-I-,MAVS-, TBK1-, TRIF-, MDA5,及IRF3-5D的表達(dá)載體與TRIP的表達(dá)載體和IFN-β報(bào)告基因的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染HEK293,報(bào)告基因結(jié)果表明,TRIP負(fù)向調(diào)控除IRF3以外的所有接頭蛋白介導(dǎo)的IFN-β的報(bào)告基因活性。以上結(jié)果說(shuō)明了TRIP的作用靶點(diǎn)可能是TBK1而非IRF3。 3.3TRIP將TBK1進(jìn)行特異性的降解 因?yàn)門(mén)RIP具有降解作用,但TRIP的作用靶點(diǎn)還不得而知,因此我們首先在腹腔原代巨噬細(xì)胞中,將TRIP進(jìn)行干擾,分別用LPS, Poly (I:C)刺激細(xì)胞,進(jìn)行Western Blotting,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)TRIP進(jìn)行干擾后,內(nèi)源性TBK1的表達(dá)量明顯升高,而IRF3, TRAF3, STAT1的表達(dá)并未受到影響。相反的,我們利高表達(dá)TRIP質(zhì)粒的RAW264.7穩(wěn)定株,重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)TRIP后,TBK1的表達(dá)量明顯降低,而TRAF3, TRAF6表達(dá)無(wú)變化。這說(shuō)明在免疫細(xì)胞中,TRIP具有特異性降解TBK1的作用。將TBK1表達(dá)載體與TRAF3表達(dá)載體分別與TRIP表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)的TRIP可以抑制TBK1載體的表達(dá),而對(duì)TRAF3載體的表達(dá)沒(méi)有影響,當(dāng)加入蛋白酶體抑制劑后TRIP對(duì)TBK1載體表達(dá)的抑制作用消失。為了確定TBK1的激酶活性會(huì)不會(huì)因?yàn)榻到舛l(fā)生變化,我們進(jìn)行了激酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn),結(jié)果證明對(duì)TRIP進(jìn)行干擾后LPS介導(dǎo)的TBK1激酶活性的發(fā)生明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果說(shuō)明TBK1是TRIP的降解靶點(diǎn),TBK1的激酶活性也因此受到TRIP的負(fù)向調(diào)控 3.4TRIP將TBK1進(jìn)行K48位的泛素化 泛素化是機(jī)體內(nèi)常見(jiàn)的一種蛋白質(zhì)修飾形式,在TLR及RLR信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的功能,K48位泛素化可以將目的蛋白進(jìn)行特異性的蛋白酶體方式降解。TRIP含有鋅指結(jié)構(gòu)域,之前也有文章預(yù)測(cè)其可能具有E3泛素連接酶功能,根據(jù)上面的降解實(shí)驗(yàn),我們猜測(cè)TRIP可能會(huì)將TBK1進(jìn)行K48位泛素化。E3連接酶將目的分子泛素化的的前提是兩個(gè)分子發(fā)生結(jié)合,因此,首先我們將TBK1表達(dá)載體,IRF3表達(dá)載體與TRAF3表達(dá)載體分別與TRIP表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIP可以與TRAF3, TBK1發(fā)生結(jié)合。將RAW264.7用LPS刺激后,用TBK1特異性抗體做免疫共沉淀,發(fā)現(xiàn)TRIP可以與TBK1發(fā)生內(nèi)源性結(jié)合.由于TRIP僅對(duì)TBK1進(jìn)行降解,對(duì)TRAF3沒(méi)有作用,因此我們猜測(cè),TRIP的泛素化靶點(diǎn)應(yīng)該是TBK1. 我們要進(jìn)一步確定TRIP是否能將TBK1進(jìn)行泛索化,首先我們將野生型TRIP,E3連接酶活性缺失點(diǎn)突變TRIP與TBK1表達(dá)載體,泛索表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293,免疫共沉淀后發(fā)現(xiàn),TRIP可以將TBK1進(jìn)行泛素化。進(jìn)一步要證明泛素化以何種形式進(jìn)行,我們將TRIP表達(dá)載體,TBK1表達(dá)載體分別于野生型泛素表達(dá)載體,K48位點(diǎn)突變泛素表達(dá)載體,K63位泛素表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293,免疫共沉淀發(fā)現(xiàn),TRIP可以將TBK1進(jìn)行K48位泛素化而非K63位泛素化。 4. TRIP抵抗病毒的生理意義 4.1TRIP抑制病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生 IFN-β在機(jī)體抵抗機(jī)體抵抗病的重要分子,前面已經(jīng)證明TRIP可以負(fù)向調(diào)控RIG-1介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生,那么TRIP會(huì)不會(huì)影響病毒介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生,進(jìn)而影響VSV的復(fù)制?首先將TRIP過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293,進(jìn)而用Sev感染細(xì)胞活化IFN-β(?)的產(chǎn)生,RT-PCR及ELISA結(jié)果顯示，TRIP過(guò)表達(dá)可以負(fù)向理控Sev介導(dǎo)的IFN-β及RANTES f的產(chǎn)生。在HEK293I中利用共轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因技術(shù),我們可以看到TRIP可以負(fù)向調(diào)控Sev介導(dǎo)的IFN-β報(bào)告基因活性。而將TRIP在小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞中進(jìn)行干擾后，再用Sev感染,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾TRIP后Sev介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生明顯升高。將IRIP在HEK293十進(jìn)行過(guò)表達(dá),Sev感染后進(jìn)行非變性電泳,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TRIP會(huì)抑制IRF3的二聚化。在IIEK293中轉(zhuǎn)染TRIP超表達(dá)載體,用Sev刺激時(shí)間點(diǎn)，Western Blotting結(jié)果顯示，，干擾TRIP可以促進(jìn)內(nèi)源性TBK1的表達(dá),磷酸激酶實(shí)驗(yàn)同樣證明HRIP可以降低TBK1的激酶活性。這些結(jié)果說(shuō)明TRIP可以負(fù)向調(diào)控Sev介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。 4.2TRIP促進(jìn)病毒的逃逸 前面一系列結(jié)果展示了TRIP可以影響病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，我們想探討TRIP是否可以直接調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制。我們選用了VSV病毒，該病毒同Sev一樣是單鏈RNA病毒，可以活化RIG-I介導(dǎo)的FN-β,比更適用于病毒空斑實(shí)驗(yàn)研究。首先將TRIP過(guò)農(nóng)達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293,24小時(shí)后,用Poly(I:C轉(zhuǎn)染HEK293,6小時(shí)后用VSV感染,培養(yǎng)24小時(shí)收集上清及細(xì)胞RNA,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)TRIP可以直接促進(jìn)VSV的復(fù)制,而TRIP的E3連接酶活性缺失突變體則失去這一功能。將TRIP的干擾RNA轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,36小時(shí)后用Poly(LC)刺激細(xì)胞,6小時(shí)后再用VSV感染,24小時(shí)后收集上清及細(xì)胞RNA,結(jié)果顯示,將TRIP進(jìn)行干擾后可以直接抑制VSV的復(fù)制。 四.結(jié)論及創(chuàng)新性 1.世界上首次證明TBK1的K48位泛素化調(diào)控方式 TBK1是固有免疫信號(hào)通路中非常重要的一員,通過(guò)其磷酸激酶活性調(diào)控大量基因的表達(dá),TBK1激酶活性是如何調(diào)控的還不太清楚。已有文獻(xiàn)報(bào)道,TBK1可以被磷酸化或K63位泛素化,進(jìn)而促進(jìn)TBK1及活化,但TBK1如何被負(fù)向調(diào)控至今仍未有報(bào)道,我們首次證明TBKl可以被TRIP進(jìn)行K48位泛素化,進(jìn)而發(fā)生降解,完善了RLR及TLR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。 2.首次證明了TRIP具有體內(nèi)泛素化功能 已有報(bào)道對(duì)TRIP的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行了預(yù)測(cè),猜測(cè)TRIP是一種E3泛素連接酶,并進(jìn)行了體外泛素化驗(yàn)證,但TRIP是否在體內(nèi)具有泛素化功能,其作用靶點(diǎn)是什么都還不知道,我們的研究證明TRIP在體內(nèi)的確是一種E3連接酶,并通過(guò)其泛素化功能調(diào)節(jié)TLR劑RLR信號(hào)通路。 3.揭示了一條新的病毒逃逸機(jī)制 病毒感染機(jī)體后,機(jī)體會(huì)對(duì)病毒殺傷,而病毒也會(huì)產(chǎn)生抵抗機(jī)體的逃逸機(jī)制,兩種作用相互抗衡。我們研究發(fā)現(xiàn)單鏈RNA病毒感染機(jī)體后產(chǎn)生IFN-β殺傷病毒,同時(shí)病毒會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體高表達(dá)TRIP,高表達(dá)的TRIP負(fù)反饋調(diào)控RLR及TLR信號(hào)通路,關(guān)閉IFN-β的生成,促進(jìn)病毒的逃逸。 5.為抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的靶點(diǎn) 目前全世界病毒泛濫,如HBV, HIV, SARS以及剛剛發(fā)現(xiàn)的H7N9等,因此生產(chǎn)研發(fā)針對(duì)病毒的藥物迫在眉睫,通過(guò)我們的研究，可以提出一個(gè)假設(shè)：如果我們篩選出一種可以特異性降低TRIP表達(dá)的藥物,當(dāng)機(jī)體感染病毒時(shí)服用,TRIP表達(dá)量降低,病毒的復(fù)制也會(huì)隨之降低,這位抗病毒藥物的研發(fā)進(jìn)行了很好的提示。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：B
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2630572