【摘要】： 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的飛速發(fā)展，近年來發(fā)現(xiàn)多種具有特定生物催化功能的酶性DNA分子（catalytic DNA），即所謂脫氧核酶（deoxyribozyme）。脫氧核酶結(jié)構(gòu)不同，生物催化功能也相異；其中，活性中心為5'-GGCTAGCTACAACGA-3'，能特異性剪切RNA分子的脫氧核酶在基因調(diào)控中的潛在應(yīng)用價(jià)值尤為引人注目。與反義寡脫氧核苷酸（ASODN）相比，脫氧核酶分子既具有一定的反義抑制效果，又能通過改變RNA分子的空間構(gòu)象以促其斷裂；一個(gè)脫氧核酶分子可剪切多個(gè)RNA分子。與核酶相比，脫氧核酶識(shí)別的位點(diǎn)為5'…Y↓R…3'（Y＝A／G，R＝U／C），有更多可供選擇的靶位，且性質(zhì)相對穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)相對簡單。因此，它可能兼具核酶和ASODN的優(yōu)勢。應(yīng)用脫氧核酶抗HIV-1、HPV-16、多種惡性腫瘤相關(guān)基因mRNA等的初步研究已顯示了不同程度的效果，但應(yīng)用脫氧核酶抗肝炎病毒的研究鮮見。 病毒性肝炎至今仍缺乏充分有效的治療措施。長期以來人們不斷在探索各種可能的治療新策略；脫氧核酶的發(fā)現(xiàn)為這種嘗試提供了新的機(jī)遇。本課題通過分析丙型肝炎病毒5'-非編碼區(qū)及部分C區(qū)（HCV 5'-NCR-C）的序列和5'-NCR的二級結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)4組3類共12種脫氧核酶，對其在體外分子水平、轉(zhuǎn)基因肝癌細(xì)胞和感染有HCV的胎肝細(xì)胞水平的剪切和/或抑制活性進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià)，探討其用作抗肝炎病毒基因調(diào)控或治療的可能性。 一、丙型肝炎病毒特異性脫氧核酶的設(shè)計(jì)和靶位篩選 靶位的選擇是脫氧核酶的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)，需結(jié)合多方面的因素加以考慮。HCV 5'-NCR高度保守，含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）等關(guān)鍵功能區(qū)�；瘜W(xué)探測、核酸酶消化試驗(yàn)、熱力學(xué)（自由能）推算及計(jì)算機(jī)模擬等均顯示其二級結(jié)構(gòu)可劃分為Ⅰ～Ⅳ區(qū)。Ⅰ區(qū)可能有阻止病毒翻譯啟動(dòng)的作用；Ⅱ區(qū)可穩(wěn)定5'-NCR的空間結(jié)構(gòu)及其與宿主核糖體等的結(jié)合，從而消除Ⅰ區(qū)的影響；Ⅲ和Ⅳ區(qū)是IRES的主要跨越區(qū)域，是5'-NCR最為重要的翻譯啟動(dòng)和調(diào)控功能區(qū)。因此，靶位選擇主要應(yīng)在Ⅲ和Ⅳ區(qū)進(jìn)行，適當(dāng)兼顧Ⅱ區(qū)，避免位于Ⅰ區(qū)。5'-NCR在不同的臨床分離株仍存在一定變異；為了保證所設(shè)計(jì)的脫氧核酶對各臨床分離株具有普遍性作用，應(yīng)避免選擇存在堿基變異的區(qū)域作靶序列。此外，雖然符合5'…R↓Y…3' 特征的位點(diǎn)均有可能是脫氧核酶的作用靶位，但5'…A↓U…3' 或5'…G↓U…3' 可能相對易被切開，是優(yōu)先考慮的位點(diǎn)。 通過測序確證質(zhì)粒pHCV-neo中HCV 5'-NCR-C的序列后，根據(jù)5'-NCR的二級結(jié)構(gòu)模型和脫氧核酶所能識(shí)別的底物序列特征，綜合比較HCV 5'-NCR中各潛在靶位所 WP=12 處的功能區(qū)域和局部結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，確定第-232、-127、-84和+1共4個(gè)位點(diǎn)為研究對象，從而分別設(shè)計(jì)出3類脫氧核酶，即未經(jīng)修飾的脫氧核酶（DRz）、兩端各有兩個(gè)堿基被硫代修飾的脫氧核酶（TDRz）和活性中心人工突變的脫氧核酶（MDRz）。 二、丙型肝炎病毒特異性脫氧核酶在細(xì)胞外分子水平的剪切活性 用限制性內(nèi)切酶Nar I將pHCV-neo完全線性化，以WizardR DNA純化系統(tǒng)回收長3133bp的HCV RNA 5'-NCR-C轉(zhuǎn)錄模板。以T7轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄獲取HCV 5'-NCR-C，用CIP去除其5' 端磷酸，再以T4聚核苷酸激酶和γ-32p-ATP進(jìn)行5' 端標(biāo)記。產(chǎn)物用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離純化。各剪切反應(yīng)體系分別含每種DRz、TDRz或MDRz 5μmol/L（兩種TDRz聯(lián)合應(yīng)用時(shí)各為2.5μmol/L），放射性標(biāo)記底物200nmol/L，在合適的pH及Mg2+濃度下，混合物經(jīng)適當(dāng)變性、復(fù)性并于37℃孵育一定時(shí)間后，進(jìn)行8%變性PAGE，-70℃放射自顯影，應(yīng)用Gel DocTM 2000型凝膠成像分析儀分析各條帶光密度值并計(jì)算剪切百分率。結(jié)果顯示，各脫氧核酶定點(diǎn)剪切底物RNA的能力相差較大，以DRz-127、TDRz-127和DRz1、TDRz1的活性相對較高；37℃孵育90min后，剪切率分別達(dá)32.6%、30.8%和24.3%、21.5%。 TDRz與對應(yīng)DRz相比，剪切率無顯著性差別，提示適當(dāng)硫代修飾對脫氧核酶活性無明顯影響。MDRz無產(chǎn)物條帶，提示基本喪失剪切能力，表明脫氧核酶活性中心基序（motif）高度保守。TDRz-127和TDRz1的單獨(dú)及聯(lián)合剪切率分別從15min時(shí)的8.3%、7.4%和15.1%提升到90min時(shí)的31.1%、20.3%和42.6%，提示聯(lián)合應(yīng)用有一定的疊加效應(yīng)。反應(yīng)75～90min后剪切率難以進(jìn)一步提升，可能與靶位是否得當(dāng)、底物結(jié)合區(qū)長度是否優(yōu)化以及底物二級結(jié)構(gòu)的形成等有關(guān)。由于堿基構(gòu)成不同，對底物結(jié)合區(qū)進(jìn)行優(yōu)化有可能在一定程度上改善活性。HCV RNA全長約9400nt，必然較單純5'-NCR-C形成更復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞內(nèi)環(huán)境較細(xì)胞外環(huán)境復(fù)雜得多；因此，，有必要在細(xì)胞水平進(jìn)一步評價(jià)脫氧核酶的活性。 三、丙型肝炎病毒特異性脫氧核酶在轉(zhuǎn)基因肝癌細(xì)胞株中的活性 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株和化學(xué)發(fā)光法可以快速、準(zhǔn)確地評價(jià)脫氧核酶在細(xì)胞內(nèi)對靶基因的作用效果。理論上，脫氧核酶在細(xì)胞內(nèi)對靶RNA的總抑制活性包括反義抑制和定點(diǎn)剪切兩個(gè)方面。通常設(shè)計(jì)一組無剪切活性但反義抑制效果相似的對照組（MDRz）進(jìn)行比較以間接推證剪切效應(yīng)。HCV 5'-NCR-C調(diào)控性熒光素酶轉(zhuǎn)基因HepG2.9706細(xì)胞以每孔1×104/100μl接種于96孔培養(yǎng)板，孵育適當(dāng)時(shí)間后給予不同濃度的脫氧核酶，給予方法包括Lipofectin轉(zhuǎn)染5h、直接給予5h或24h。細(xì)胞培養(yǎng)完畢后，向
【圖文】：

、二級結(jié)構(gòu)及特異性脫氧核酶對靶序列結(jié)構(gòu)特征的要求等多在提取高純度質(zhì)粒 pHCV-Neo 并對其所含的 HCV 5’-NCR通過計(jì)算機(jī)模擬和查閱文獻(xiàn)，獲取數(shù)種 HCV 5’-NCR 二級多組 HCV 靶向性脫氧核酶。材料和方法V-Neo 的主要結(jié)構(gòu)見圖 1-1。該質(zhì)粒由我所王小紅博士惠贈(zèng)， HCV 5’-NCR（341nt）及包括翻譯起始密碼子在內(nèi)的 C 8nt），與畢勝利等報(bào)道的中國人 HCV 5’-NCR 及 C 區(qū) 5’端序提取試劑盒（High Pure Plasmid Isolation Kit）為 Roche 公司ABI PRISM 377 型。

剪切產(chǎn)物所在條帶總光密度值（%）＝未剪切產(chǎn)物所在條帶總光密度值＋剪切產(chǎn)物所在條帶的總光密度值×100%結(jié) 果V 5’-NCR-C的體外轉(zhuǎn)錄模板CV-Neo 全長約 7549bp，存在兩個(gè) Nar I 酶切位點(diǎn)和一個(gè) Sal I 位泳顯示應(yīng)用 Nar I 消化可獲得 7549bp、4416bp 和 3133bp 三個(gè)片獲得 7549bp 一個(gè)片段。見圖 2-2。M N1 N2 SalM Nar
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 于樂成,顧長海,王升啟,毛青;基因治療新策略——酶性DNA的設(shè)計(jì)和應(yīng)用[J];中國藥物化學(xué)雜志;2002年04期

2 汪智鴻,王其甫,ZeuzemS;丙型肝炎患者HCV RNA的分布及其影響因素[J];重慶醫(yī)學(xué);1995年02期

3 魏來,陶其敏;構(gòu)建T載體快速克隆丙型肝炎病毒5′端非編碼區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1997年04期

4 王安輝;丙型肝炎病毒及其相關(guān)的肝細(xì)胞肝癌[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;1998年01期

5 邱國華,杜紹財(cái),孫南雄,尤鵬,范曉峰,張永祥,魏來;丙型肝炎病毒非編碼區(qū)ABC程序酶切分型研究[J];中華肝臟病雜志;2004年04期

6 馬立人,王全立,唐時(shí)幸;丙型肝炎病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];臨床肝膽病雜志;1994年02期

7 李水仙,康潤田,車德才;丙型肝炎病毒分子生物學(xué)若干問題的研究現(xiàn)狀[J];長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1998年02期

8 楊中漢,馮建生;脫氧核酶:生物催化劑的新成員[J];生命的化學(xué);2000年02期

9 王曉博;脫氧核酶的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊;2002年02期

10 盧忠心;脫氧核酶及其應(yīng)用進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).分子生物學(xué)分冊;2003年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 孫侖泉;;新型基因抑制工具:脫氧核酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用[A];中國病理生理學(xué)會(huì)受體、腫瘤和免疫專業(yè)委員會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

2 牛淑妍;姜禹;張書圣;;基于17E脫氧核酶特異性熒光檢測Pb~(2+)[A];第十屆中國化學(xué)會(huì)分析化學(xué)年會(huì)暨第十屆全國原子光譜學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

3 周薇;劉延友;王躍

本文編號：2625531