【摘要】：作為肝移植手術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥，缺血再灌注損傷是導(dǎo)致移植后原發(fā)性肝功能不全的主要原因。本研究利用離體大鼠肝臟和人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注模型，較為系統(tǒng)地研究了肝竇內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷的性質(zhì)和規(guī)律；探討了肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制；確定了丹參單體MP-1減輕肝臟缺血再灌注損傷的作用和途徑。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 缺血再灌注過(guò)程中，大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞脫落和肝細(xì)胞死亡明顯，肝功能顯著下降。人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞明顯死亡，細(xì)胞死亡率隨缺血再灌注時(shí)間的增加而增加，細(xì)胞的功能隨之下降。 使用瓊脂糖凝膠電泳方法未觀察到典型的DNA梯形條帶；用TUNEL和丫啶橙染色方法，均未見(jiàn)典型凋亡的出現(xiàn)；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)PI標(biāo)記的DNA，也未觀察到凋亡峰。由此可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭�，人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞不是以典型凋亡為主的變化，而是以細(xì)胞壞死為主的損傷。 用RT-PCR技術(shù)測(cè)定人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞TNFα、IL-8的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：缺血再灌注過(guò)程中，TNFα、IL-8的mRNA水平顯著增加；用ELISA方法檢測(cè)其蛋白釋放也有一致的結(jié)果。TNFα和IL-8的蛋白釋放與人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞死亡率呈正相關(guān)(r=0.949，P＜0.05)和(r=0.892，P＜0.05)。 用電泳遷移率阻滯實(shí)驗(yàn)觀察NF-κB的結(jié)合活性顯示：缺血再灌注過(guò)程中，人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB的結(jié)合活性顯著增加，NF-κB的結(jié)合活性與TNFα和IL-8的表達(dá)呈平行關(guān)系。 向培養(yǎng)液內(nèi)加入外源性TNFα，可促使人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的死亡；還可促進(jìn)IL-8和ICAM-1的表達(dá)以及基質(zhì)蛋白酶的活性。若加入TNFα的抗體，可減少缺血再灌注時(shí)人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，提高細(xì)胞的功能。 缺血再灌注過(guò)程中，人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)和基質(zhì)蛋白酶-2的活性以及粒細(xì)胞的粘附均以時(shí)間依賴的方式增加。粘附的粒細(xì)胞使肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷惡化，而且ICAM-1表達(dá)和粒細(xì)胞粘附的數(shù)量與人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞死亡率呈正相關(guān)(r=0.95，P＜0.05；r=0.89，P＜0.05)；加入粒細(xì)胞進(jìn)行灌注時(shí)，離體大鼠肝臟釋放的基質(zhì)蛋白酶活性進(jìn)一步增加。
【圖文】：

乎全部脫落，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量(每5個(gè)高倍視野內(nèi)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的平均數(shù))只有9.3士3.5;肝細(xì)胞水樣變性明顯，肝小葉周邊區(qū)的肝細(xì)胞脂肪變性明顯，但肝小葉結(jié)構(gòu)尚清楚，部分區(qū)域出現(xiàn)肝板破壞，肝細(xì)胞壞死(圖1.1.c，d)。臺(tái)盼藍(lán)灌流染色發(fā)現(xiàn):缺血再灌注60分鐘后，肝細(xì)胞死亡率達(dá)29.8士5.8，殘存的內(nèi)皮細(xì)胞均已死亡(圖1.1.e，，)f。缺血再灌注30和60分鐘的肝臟形態(tài)未見(jiàn)明顯差異，但再灌注60分鐘的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量以及肝細(xì)胞死亡率比再灌注30分鐘組有顯著提高。圖1.1.光鏡觀察離體大鼠肝臟缺血再灌注過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化a，b:低溫保存后的大鼠肝臟(HE染色x100和x400)。c，d:再灌注后的大鼠肝臟(HE染色x100和x4OO)。e

中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士論文1.2透射電鏡觀察離體大鼠肝臟缺血再灌注損傷的超微結(jié)構(gòu)變化缺血再灌注后，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞脫落并有粒細(xì)胞的粘附(圖1.2.a，8000X)腔不規(guī)則，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，核染色質(zhì)邊集濃縮，DISSe腔內(nèi)有粒細(xì)胞浸潤(rùn);肝竇(圖.2.b，300Ox);肝竇腔內(nèi)有中性粒細(xì)胞的粘附(圖1.2.c，3000x);肝細(xì)胞腫脹，線粒體破裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和糖原顆粒明顯減少(圖1.2.d，4000x)。圖1.2.透射電鏡觀察離體大鼠肝臟缺血再灌注損傷的超微結(jié)構(gòu)變化1.3離體大鼠肝臟功能的變化聲離體大鼠肝臟功能隨再灌注時(shí)間的增加有降低的趨勢(shì)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R363;R285

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本文編號(hào)：2626058