【摘要】：葉酸是一種水溶性B族維生素,不能由人體自身產(chǎn)生,只能從食物或藥物中獲取。葉酸主要參與一碳單位的轉(zhuǎn)移,是細胞生長和組織修復(fù)必需的物質(zhì),對胚胎發(fā)育和生長至關(guān)重要。大量臨床調(diào)查研究表明,妊娠前后補充葉酸能夠降低神經(jīng)管畸形的發(fā)生率和復(fù)發(fā)率。因此,1992年美國公共衛(wèi)生服務(wù)中心等機構(gòu)推薦育齡期婦女妊娠前后三個月每天服用400μg葉酸。從1998年開始,美國、加拿大等許多國家陸續(xù)在谷物和面粉中添加葉酸以強化葉酸的使用。我國從2009年開始免費向準備懷孕的農(nóng)村婦女提供葉酸。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,自從上述措施實施以來,神經(jīng)管畸形的發(fā)生率減少了50%-70%�；诖�,妊娠期間補充葉酸預(yù)防神經(jīng)管畸形的發(fā)生已作為一項重大公共衛(wèi)生措施長期貫徹實施。 糖尿病合并妊娠(簡稱糖尿病妊娠)是指妊娠前已患有糖尿病或原有糖尿病未被發(fā)現(xiàn),妊娠后進展為糖尿病。臨床資料統(tǒng)計,糖尿病妊娠后代先天性畸形尤其是神經(jīng)管畸形的發(fā)生率明顯增加。研究發(fā)現(xiàn),有效的血糖控制可明顯減少神經(jīng)管畸形的發(fā)生,提示由于醫(yī)療水平的改善,有更多外表健康的嬰兒出生。然而,追蹤研究發(fā)現(xiàn),這些嬰兒存在著不同程度的神經(jīng)發(fā)育缺陷。因此,研究糖尿病妊娠孕婦娩出的外表正常子代的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育情況以及采取何種有效預(yù)防措施具有十分重要的意義。臨床調(diào)查和動物實驗均表明,補充葉酸能夠降低糖尿病妊娠時神經(jīng)管畸形的發(fā)生。因此,一些專家建議糖尿病孕婦服用高劑量葉酸(4-5mg／d)以減少神經(jīng)管畸形的發(fā)生。然而,糖尿病患者妊娠期間應(yīng)用高劑量葉酸對胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響目前尚不清楚。 許多專家和學(xué)者主要從葉酸的吸收、基因的甲基化狀態(tài)等角度探討葉酸預(yù)防神經(jīng)管畸形的機制。此外,有研究表明葉酸作為抗氧化劑可以減輕糖尿病妊娠引起的氧化應(yīng)激狀態(tài),從而減少神經(jīng)管畸形的發(fā)生。盡管如此,葉酸影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的機制有待于進一步研究。中樞神經(jīng)系統(tǒng)由神經(jīng)管發(fā)育而來,而神經(jīng)管主要由神經(jīng)干細胞構(gòu)成。妊娠期間,許多營養(yǎng)物質(zhì)能夠通過影響胚胎神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡和分化最終影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。葉酸影響神經(jīng)發(fā)育的機制也可能是通過參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡、分化等過程實現(xiàn)的。然而,以往研究均來自于體外實驗,葉酸對體內(nèi)神經(jīng)干細胞的影響及機制目前尚不完全清楚。 本研究通過建立糖尿病妊娠小鼠模型,從神經(jīng)干細胞增殖、凋亡、分化和神經(jīng)元遷移角度,研究葉酸尤其是高劑量葉酸對外表正常胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響,并探討其作用機制。 第一部分葉酸對孕鼠血糖水平和胚胎發(fā)育的影響 我們首先建立糖尿病小鼠模型,根據(jù)小鼠血糖水平將實驗組分為高血糖組(6.7mM血糖水平16.7mM)和糖尿病組(血糖水平≥16.7mM)。隨后,將對照組、高血糖組和糖尿病組雌鼠分別與健康成年雄鼠合籠建立糖尿病妊娠小鼠模型,然后分別給予不同劑量葉酸(0、3mg/kg體重和15mg/kg體重),觀察葉酸對孕鼠血糖水平、胚胎發(fā)育,尤其是胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。結(jié)果顯示,高血糖組和糖尿病組孕鼠每個時間點的平均血糖水平均明顯高于對照組,而添加兩種劑量葉酸均對這兩組孕鼠的血糖水平?jīng)]有明顯影響。葉酸能夠改善高血糖組和糖尿病組孕鼠活體胚胎率,并且,補充葉酸尤其是高劑量葉酸后,兩組孕鼠胚胎神經(jīng)管畸形率明顯降低。此外,葉酸還能改善糖尿病組孕鼠胚胎的體重和頂臀長。隨后,我們對外觀正常的各組胚胎端腦切片進行HE染色,結(jié)果顯示,無論是否添加葉酸,各組胚胎端腦內(nèi)部均沒有明顯的病理改變和結(jié)構(gòu)異常。 以上結(jié)果顯示,葉酸對正常、高血糖和糖尿病妊娠母體血糖水平均無明顯作用,但是能夠明顯改善高血糖和糖尿病狀態(tài)下活體胚胎率和神經(jīng)管畸形發(fā)生率,并且可以改善糖尿病引起的胚胎體重減輕和頂臀長縮短。然而,葉酸對母體正常、高血糖和糖尿病狀態(tài)下外表正常胚胎端腦組織學(xué)結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。 第二部分葉酸對胎鼠前腦神經(jīng)上皮細胞增殖與凋亡的影響 本實驗中,我們采用BrdU摻入法檢測葉酸對E11.5胚胎前腦神經(jīng)上皮細胞增殖的影響。結(jié)果顯示,對照組孕鼠接受葉酸干預(yù)后,其胚胎前腦BrdU陽性細胞比例明顯升高；添加兩種劑量葉酸后,高血糖組和糖尿病組胚胎前腦BrdU陽性細胞比例均明顯增加。我們的研究結(jié)果表明葉酸能夠促進正常、高血糖和糖尿病妊娠胚胎前腦神經(jīng)上皮細胞的增殖。 隨后,我們采用TUNEL法檢測葉酸對E11.5胚胎前腦神經(jīng)上皮細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,對照組孕鼠應(yīng)用葉酸后,其胚胎前腦TUNEL陽性細胞比例沒有明顯變化；添加不同劑量葉酸后,高血糖組和糖尿病組胚胎前腦TUNEL陽性細胞比例均明顯減少。以上結(jié)果表明葉酸能夠減少高血糖和糖尿病妊娠胚胎前腦神經(jīng)上皮細胞的凋亡。 第三部分葉酸對胎鼠端腦神經(jīng)干細胞分化的影響及機制 本研究中我們檢測了E13.5胚胎端腦早期神經(jīng)元特異性標(biāo)記物——神經(jīng)元特異性Ⅲ型β-微管蛋白(neuronal specific class Ⅲ β-tubulin, Tuj1)的表達變化,探索母體應(yīng)用葉酸對胚胎神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的影響。免疫熒光染色結(jié)果顯不,Tuj1陽性細胞廣泛分布在E13.5胚胎端腦腦室區(qū)以外的區(qū)域,對照組、高血糖組和糖尿病組孕鼠補充葉酸后胚胎端腦中Tuj1陽性細胞明顯增多。Western blot和實時定量RT-PCR結(jié)果顯示,葉酸可促進對照組、高血糖組和糖尿病組孕鼠胚胎端腦中Tuj1蛋白和mRNA的表達。以上結(jié)果表明葉酸能夠促進正常、高血糖和糖尿病妊娠胚胎端腦神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。 隨后我們對葉酸引起神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元過早分化的機制進行了研究,主要檢測了與神經(jīng)元分化相關(guān)的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)轉(zhuǎn)錄因子的表達情況,如Neurog1、Neurog2、Mash1、NeuroD1和NeuroD2。結(jié)果顯示,對照組孕鼠應(yīng)用葉酸后,其胚胎端腦中Neurog1、Neurog2、Mash1和NeuroD2因子的mRNA水平明顯升高。高血糖組孕鼠添加正常劑量葉酸后,其胚胎端腦中Neurog1和NeuroD2因子的mRNA水平升高,添加高劑量葉酸后Neurog1、Neurog2、Mash1和NeuroD2因子的mRNA水平明顯升高。糖尿病組孕鼠應(yīng)用正常劑量葉酸后,其胚胎端腦中Neurog1因子的mRNA水平升高,應(yīng)用高劑量葉酸后Neurog1、Neurog2、Mash1和NeuroD2因子的mRNA水平明顯升高。然而,NeuroD1因子mRNA表達在各組間均無明顯變化。我們的研究結(jié)果提示神經(jīng)分化相關(guān)bHLH因子可能參與葉酸引起的胚胎端腦神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的過早分化。 另外,我們檢測了E18.5胚胎端腦星形膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)記物——膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表達變化,探索母體應(yīng)用葉酸對胚胎神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞分化的影響。結(jié)果顯示,GFAP陽性細胞主要位于端腦的腦室下區(qū)和海馬區(qū)附近,以點狀或線狀的形態(tài)呈現(xiàn),無明顯突起。補充葉酸后,對照、高血糖組和糖尿病組孕鼠胚胎端腦中GFAP陽性細胞明顯增多。Western blot和實時定量RT-PCR結(jié)果顯示,葉酸可引起對照組、高血糖組和糖尿病組孕鼠胚胎端腦中GFAP蛋白和mRNA水平升高。以上研究結(jié)果表明葉酸能夠促進正常、高血糖和糖尿病妊娠胚胎端腦神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞分化。 本研究中我們主要檢測了與星形膠質(zhì)細胞分化相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達情況,如Hes1、Hes5、Idl和Id2,探尋葉酸引起神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞過早分化的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),應(yīng)用葉酸后,對照組孕鼠胚胎端腦中Hes5、Id1和Id2因子的mRNA水平明顯增加；兩種劑量葉酸均可明顯增加高血糖組孕鼠胚胎端腦中Hes5、Idl和Id2因子mRNA的表達；糖尿病組孕鼠應(yīng)用正常劑量葉酸后,其胚胎端腦中Hes5和Idl因子的uRNA水平明顯增加,應(yīng)用高劑量葉酸可使Hes5、Idl和Id2因子mRNA水平明顯升高。但是,Hes1因子的mRNA表達水平在各組間無明顯變化。以上結(jié)果提示膠質(zhì)分化相關(guān)bHLH因子可能參與葉酸引起的胚胎端腦神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞的過早分化。 第四部分葉酸對胎鼠端腦神經(jīng)元遷移的影響 本研究中我們還檢測了葉酸對E13.5胚胎端腦神經(jīng)元遷移的影響。雙皮層蛋白(doublecortin, DCX)是一種微管相關(guān)蛋白,主要在遷移神經(jīng)元中表達。免疫熒光染色結(jié)果顯示,補充葉酸后,對照組、高血糖組和糖尿病組孕鼠胚胎端腦中DCX陽性細胞明顯增多。Western blot結(jié)果顯示,對照組、高血糖組和糖尿病組孕鼠添加正常劑量葉酸后其胚胎端腦中DCX蛋白表達沒有明顯變化；高血糖組和糖尿病組孕鼠添加高劑量葉酸后,胚胎端腦中DCX蛋白水平明顯升高。以上結(jié)果提示葉酸可能影響母體正常、高血糖和糖尿病狀態(tài)下胚胎端腦神經(jīng)元的遷移。 總之,葉酸不僅能夠促進對照組、高血糖組和糖尿病組胚胎前腦神經(jīng)干細胞增殖,抑制高血糖組和糖尿病組胚胎前腦神經(jīng)干細胞凋亡,還能促進對照組、高血糖組和糖尿病組胚胎端腦神經(jīng)元的遷移,提示葉酸有助于胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。然而,葉酸尤其是高劑量葉酸,可能加重高血糖組和糖尿病組胚胎端腦神經(jīng)干細胞的過早分化,干擾腦內(nèi)環(huán)境,最終可能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育過程。本研究結(jié)果提示,高血糖和糖尿病婦女在妊娠前后服用葉酸時需謹慎,因為葉酸尤其是高劑量葉酸對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響具有兩面性。我們的研究為指導(dǎo)妊娠期間尤其是高血糖和糖尿病妊娠期間合理應(yīng)用葉酸提供了實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R321

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本文編號：2625509