【摘要】： 大塊骨缺損的修復(fù)及各種原因?qū)е碌墓钦鄄挥现两袢允枪峭饪?領(lǐng)域尚待解決的重大課題，組織工程這門(mén)新興學(xué)科的興起使骨損傷的 修復(fù)邁向了一個(gè)新的時(shí)代。組織工程中一個(gè)首要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是尋 找滿足要求和易于操作的種子細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)成人骨髓存在間充質(zhì) 干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC），它們是一群具有多向分化潛 能的均質(zhì)性細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種間充質(zhì)組織細(xì)胞， 如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞 等。在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的過(guò)程中，MSC始終保持其多向分化潛能，且遺傳 背景相當(dāng)穩(wěn)定，體內(nèi)植入反應(yīng)較弱，是一種理想的組織工程種子細(xì)胞。 然而，人體內(nèi)骨髓中MSC的含量極其稀少，每1×10~5-1×10~6個(gè)單個(gè)核 細(xì)胞中大約有1個(gè)MSC，組織工程中對(duì)種子細(xì)胞的數(shù)量要求巨大，如此 微量的MSC難以滿足組織工程的需要，因此體外純化和擴(kuò)增MSC就顯 得尤為重要。在本次實(shí)驗(yàn)對(duì)MSC的分離純化方法是基于Friedenstein 的經(jīng)典方法進(jìn)行的改進(jìn)。具體的做法是從正常成人肋骨獲得的骨髓細(xì) 胞，用密度為1.073的Percoll分離后接種在含MSC專(zhuān)用培養(yǎng)基 （Mesencult）的塑料培養(yǎng)瓶中，三天后用新鮮培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行全量換 液，以后每周換液兩次。待MSCs生長(zhǎng)達(dá)80％融合狀態(tài)時(shí)，用胰酶進(jìn)行消 化后按1：3的比列接種在三個(gè)塑料培養(yǎng)瓶中。在本次實(shí)驗(yàn)中成人間充 質(zhì)干細(xì)胞共擴(kuò)增了15代，最后獲得7.5×10~(12)個(gè)MSC，擴(kuò)增約1.36×10~7 博士學(xué)位論文 中文摘要 倍。 動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，用全骨髓移植到骨缺損處可觀察到骨和軟骨 的形成，但這種轉(zhuǎn)化具有隨機(jī)性，且轉(zhuǎn)化效率比較低，因此對(duì)其進(jìn)行 預(yù)分化處理就顯得非常的重要。我們?cè)谶M(jìn)行定向誘導(dǎo)分化的同時(shí)比較 了不同擴(kuò)增代數(shù)的間充質(zhì)干細(xì)胞向骨和軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。具體的 實(shí)驗(yàn)方法是在成骨誘導(dǎo)體系中，MSCS接種24 ，J’時(shí)后，加入誘導(dǎo)劑10－’ mol＊地塞米松、10us／。16－甘油磷酸鈉（p－GP）和 50 u g加l的抗壞 血酸。在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中，間充質(zhì)干細(xì)胞首先被低速離心成細(xì) 胞微團(tuán)，，然后加入特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑10叼加ITGF十3。在誘 導(dǎo)過(guò)程中動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)的改變和相應(yīng)的生化和免疫學(xué)指標(biāo)：I、11 型膠原纖維，堿性磷酸酶、鈣沉積和酸性蛋白聚糖。通過(guò)以上指標(biāo)證 實(shí)我們?cè)隗w外己成功的誘導(dǎo)了MSCS分化為骨和軟骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) 不同擴(kuò)增代數(shù)的MSC依然保持了向骨和軟骨細(xì)胞分化的潛能。這一研 究將為間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)、技術(shù)方法和豐富的種 子細(xì)胞。 體外擴(kuò)增MSC的實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到成人和胎兒MSCS的增殖潛能 具有明顯的差異，另有文獻(xiàn)報(bào)道胎兒MSC的分化潛能明顯強(qiáng)于成人MSC， 而胚胎期特異表達(dá)的基因可能在MSC的增殖分化過(guò)程中扮演重要的角 色，對(duì)這些分子的發(fā)掘和研究將有助于提高我們對(duì)成人MSC增殖分化 的調(diào)控，有助于發(fā)現(xiàn)與MSC定向分化相關(guān)的特異基因，而針對(duì)這些特 異的基因進(jìn)行調(diào)控將顯著提高成人MSC定向分化的效率，因此，研究 成人和胎兒間MSC基因表達(dá)的差異就顯得極其的重要。基于上述理由， 我們聯(lián)合應(yīng)用了抑制削減雜交和基因芯片技術(shù)篩選胎兒和成人MSC中 差異表達(dá)的基因。 4 博土學(xué)位論文 中文摘要 我們首先應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)建立了胎兒MSC的CDNA消減文 庫(kù)。該方法通過(guò)將連有不同接頭的兩種待檢樣品CDNA分別與過(guò)量的對(duì) 照樣品CDNA進(jìn)行雜交后，合并繼續(xù)進(jìn)行第H輪雜交，并且在雜交后利 用對(duì)應(yīng)于接頭的特異性引物進(jìn)行兩輪抑制性PCR，擴(kuò)增的產(chǎn)物通常便是 同對(duì)照樣品相比待檢樣品中差異（高）表達(dá)的基因。由于在雜交過(guò)程 中引入過(guò)量的對(duì)照樣品CDNA而使高、低豐度CDNA水平趨于一致，即 均衡化＊ zation人 所以對(duì)于分離低豐度的差異表達(dá)基因十分 有效。在我們建立的胎兒CDNA消減文庫(kù)中包括了890個(gè)克隆，最后通 過(guò)PCR檢測(cè)獲得了768個(gè)陽(yáng)性克隆。通過(guò)SSH方法建立的消減CDNA文 庫(kù)可以同其它高通量篩選技術(shù)聯(lián)合，對(duì)文庫(kù)中的片段進(jìn)行高效篩選。 因此，我們采用了基因芯片技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了高通量的篩選。本實(shí)驗(yàn) 通過(guò)PCR方法對(duì)消減文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增，并利用芯片制備系 統(tǒng)的機(jī)械手將擴(kuò)增產(chǎn)物有序地點(diǎn)在處理過(guò)的載玻片上，制成基因芯片。 將該芯片與不同熒光素標(biāo)記的胎兒和正常成人MSC單鏈CDNA進(jìn)行雜 交，經(jīng)不同嚴(yán)謹(jǐn)度洗片處理后，利用不同波長(zhǎng)激光激發(fā)并讀取各克隆 散射的熒光信號(hào)，計(jì)算機(jī)定量分析信號(hào)強(qiáng)度，確定每個(gè)dNA克隆在兩 種組織中的相對(duì)表達(dá)水平，從而判斷出在胎兒和正常成人MSC中差異 表達(dá)的CDNA克隆。通過(guò)判定胎兒和成人MSC兩者雜交信號(hào)比值小于0．3 和大于3的為胎兒中差異表達(dá)的基因。在我們的結(jié)果分析中。胎兒MSC 中高表達(dá)的克隆共有300個(gè)。從300個(gè)高表達(dá)的克隆中隨機(jī)挑選了85 個(gè)克隆進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)六個(gè)新基因片段，對(duì)其中克隆91號(hào)，嘗試 采用silico c1One方法進(jìn)行全長(zhǎng)的拼接，最后獲得
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 韋林蓋;蒙古羊間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)分化[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2625202