【摘要】： 大塊骨缺損的修復及各種原因?qū)е碌墓钦鄄挥现两袢允枪峭饪?領域尚待解決的重大課題，組織工程這門新興學科的興起使骨損傷的 修復邁向了一個新的時代。組織工程中一個首要解決的關鍵問題是尋 找滿足要求和易于操作的種子細胞。目前已發(fā)現(xiàn)成人骨髓存在間充質(zhì) 干細胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC），它們是一群具有多向分化潛 能的均質(zhì)性細胞，在特定的誘導條件下可分化為多種間充質(zhì)組織細胞， 如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞、肝細胞和神經(jīng)細胞 等。在體外長期培養(yǎng)的過程中，MSC始終保持其多向分化潛能，且遺傳 背景相當穩(wěn)定，體內(nèi)植入反應較弱，是一種理想的組織工程種子細胞。 然而，人體內(nèi)骨髓中MSC的含量極其稀少，每1×10~5-1×10~6個單個核 細胞中大約有1個MSC，組織工程中對種子細胞的數(shù)量要求巨大，如此 微量的MSC難以滿足組織工程的需要，因此體外純化和擴增MSC就顯 得尤為重要。在本次實驗對MSC的分離純化方法是基于Friedenstein 的經(jīng)典方法進行的改進。具體的做法是從正常成人肋骨獲得的骨髓細 胞，用密度為1.073的Percoll分離后接種在含MSC專用培養(yǎng)基 （Mesencult）的塑料培養(yǎng)瓶中，三天后用新鮮培養(yǎng)基對其進行全量換 液，以后每周換液兩次。待MSCs生長達80％融合狀態(tài)時，用胰酶進行消 化后按1：3的比列接種在三個塑料培養(yǎng)瓶中。在本次實驗中成人間充 質(zhì)干細胞共擴增了15代，最后獲得7.5×10~(12)個MSC，擴增約1.36×10~7 博士學位論文 中文摘要 倍。 動物體內(nèi)實驗表明，用全骨髓移植到骨缺損處可觀察到骨和軟骨 的形成，但這種轉(zhuǎn)化具有隨機性，且轉(zhuǎn)化效率比較低，因此對其進行 預分化處理就顯得非常的重要。我們在進行定向誘導分化的同時比較 了不同擴增代數(shù)的間充質(zhì)干細胞向骨和軟骨細胞轉(zhuǎn)化的能力。具體的 實驗方法是在成骨誘導體系中，MSCS接種24 ，J’時后，加入誘導劑10－’ mol＊地塞米松、10us／。16－甘油磷酸鈉（p－GP）和 50 u g加l的抗壞 血酸。在成軟骨誘導培養(yǎng)體系中，間充質(zhì)干細胞首先被低速離心成細 胞微團，，然后加入特定的誘導培養(yǎng)基和誘導劑10叼加ITGF十3。在誘 導過程中動態(tài)觀察細胞形態(tài)的改變和相應的生化和免疫學指標：I、11 型膠原纖維，堿性磷酸酶、鈣沉積和酸性蛋白聚糖。通過以上指標證 實我們在體外己成功的誘導了MSCS分化為骨和軟骨細胞，實驗中發(fā)現(xiàn) 不同擴增代數(shù)的MSC依然保持了向骨和軟骨細胞分化的潛能。這一研 究將為間充質(zhì)干細胞的臨床應用提供理論依據(jù)、技術方法和豐富的種 子細胞。 體外擴增MSC的實驗中，我們觀察到成人和胎兒MSCS的增殖潛能 具有明顯的差異，另有文獻報道胎兒MSC的分化潛能明顯強于成人MSC， 而胚胎期特異表達的基因可能在MSC的增殖分化過程中扮演重要的角 色，對這些分子的發(fā)掘和研究將有助于提高我們對成人MSC增殖分化 的調(diào)控，有助于發(fā)現(xiàn)與MSC定向分化相關的特異基因，而針對這些特 異的基因進行調(diào)控將顯著提高成人MSC定向分化的效率，因此，研究 成人和胎兒間MSC基因表達的差異就顯得極其的重要�；谏鲜隼碛�， 我們聯(lián)合應用了抑制削減雜交和基因芯片技術篩選胎兒和成人MSC中 差異表達的基因。 4 博土學位論文 中文摘要 我們首先應用抑制消減雜交技術建立了胎兒MSC的CDNA消減文 庫。該方法通過將連有不同接頭的兩種待檢樣品CDNA分別與過量的對 照樣品CDNA進行雜交后，合并繼續(xù)進行第H輪雜交，并且在雜交后利 用對應于接頭的特異性引物進行兩輪抑制性PCR，擴增的產(chǎn)物通常便是 同對照樣品相比待檢樣品中差異（高）表達的基因。由于在雜交過程 中引入過量的對照樣品CDNA而使高、低豐度CDNA水平趨于一致，即 均衡化＊ zation人 所以對于分離低豐度的差異表達基因十分 有效。在我們建立的胎兒CDNA消減文庫中包括了890個克隆，最后通 過PCR檢測獲得了768個陽性克隆。通過SSH方法建立的消減CDNA文 庫可以同其它高通量篩選技術聯(lián)合，對文庫中的片段進行高效篩選。 因此，我們采用了基因芯片技術對文庫進行了高通量的篩選。本實驗 通過PCR方法對消減文庫中的陽性克隆進行擴增，并利用芯片制備系 統(tǒng)的機械手將擴增產(chǎn)物有序地點在處理過的載玻片上，制成基因芯片。 將該芯片與不同熒光素標記的胎兒和正常成人MSC單鏈CDNA進行雜 交，經(jīng)不同嚴謹度洗片處理后，利用不同波長激光激發(fā)并讀取各克隆 散射的熒光信號，計算機定量分析信號強度，確定每個dNA克隆在兩 種組織中的相對表達水平，從而判斷出在胎兒和正常成人MSC中差異 表達的CDNA克隆。通過判定胎兒和成人MSC兩者雜交信號比值小于0．3 和大于3的為胎兒中差異表達的基因。在我們的結(jié)果分析中。胎兒MSC 中高表達的克隆共有300個。從300個高表達的克隆中隨機挑選了85 個克隆進行序列分析，發(fā)現(xiàn)六個新基因片段，對其中克隆91號，嘗試 采用silico c1One方法進行全長的拼接，最后獲得
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：R346

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 韋林蓋;蒙古羊間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及體外誘導分化[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2013年

本文編號：2625202