【摘要】：甲肝病毒是小核糖核酸病毒科肝病毒屬的唯一成員，，有著獨特的生物學特性。甲肝病毒一般不引起宿主細胞病變，生長緩慢，周期長，最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)時間需3至4周，病毒產(chǎn)量不高。這使得對感染性甲肝病毒的檢測和滴定變得十分困難和復(fù)雜，目前尚沒有建立快速的方法。介導(dǎo)蛋白翻譯起始的甲肝病毒內(nèi)部核糖體進入位點(Internal ribosome entry sites；IRES)的結(jié)構(gòu)和功能也與眾不同，被單獨劃歸一類。本研究對檢測感染性甲肝病毒快速方法的建立和用異源IRES或5’非編碼區(qū)替換甲肝病毒相應(yīng)順式作用元件的可行性進行了探索。 我們提出了通過檢測病毒復(fù)制時出現(xiàn)的標志物負鏈RNA中間體來判斷感染性病毒存在的新思路，建立了一種快速、特異性地檢測感染性甲肝病毒的新方法，即細胞培養(yǎng)／鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)法(Integrated cell culture／strand-specific transcriptase-polymerase chain reaction；鏈特異性ICC／RT-PCR)，其技術(shù)路線為病毒經(jīng)細胞培養(yǎng)后，用鏈特異性RT-PCR檢測負鏈RNA，以判定感染性甲肝病毒的存在。鏈特異性ICC／RT-PCR法結(jié)合了細胞培養(yǎng)法與分子生物學方法特點，可區(qū)分感染性病毒和失活病毒，可將感染性甲肝病毒的檢測時間由細胞培養(yǎng)法的3至4周減少到1周左右。該法對感染性病毒有著較好的特異性，滴度為10~(7.0)TCID_(50)／ml的甲肝病毒經(jīng)滅活后未產(chǎn)生假陽性結(jié)果；該法有著較高的靈敏度，可經(jīng)細胞培養(yǎng)84小時后檢測到模擬水樣中滴度為10~0TCID_(50)／ml的感染性甲肝病毒。在用該法檢測活疫苗樣品Ref的感染性滴度時，培養(yǎng)時間為5天的結(jié)果為10~(7.83) TCID_(50)／ml，培養(yǎng)時間為8天的結(jié)果為10~(8.0)TCID_(50)／ml，與目前常用ELISA法的檢測結(jié)果(10~(7.67) TCID_(50)／ml)相近。鏈特異性ICC／RT-PCR法可應(yīng)用于食品、水與環(huán)境病毒安全性的監(jiān)測，活疫苗感染性滴度的檢測和甲型肝炎的分子流行病學研究，也可應(yīng)用于滅活疫苗的滅活效力與食品、水中對甲肝病毒或腸道病毒消毒效果的評估。原則上，使用相應(yīng)的引物，鏈特異ICC／RT-PCR法可用于檢測其它感染性小核糖核酸病毒。
【圖文】：

分別用一步法Rl’-pcR和鏈特異性Rl’-pCR檢測提取自140貝病毒標準樣品A(滴度為1;.0“TcIDs沁)l和系列10倍稀釋樣品(10一，至10一，)的NRA正鏈樣品。如圖2所示，經(jīng)第一輪擴增后，一步法R-rPcR可檢測到滴度為1.02“TCIDS了ml的RNA樣品;經(jīng)第二輪擴增后，可檢測到滴度為100TcDI5m0l的RNA樣品(圖3)。但是，用鏈特異性R-TPCR檢測時，二輪擴增8個樣品都不產(chǎn)生陽性PCR產(chǎn)物(圖4，5)。這表明本研究中采用的標簽Rl’-PCR方法有很高的負鏈特異性，適用于后續(xù)實驗的甲肝病毒負鏈RNA檢測。同時，一步法Rl’-PCR中第一輪與第二輪擴增的終點結(jié)果差兩個數(shù)量級

增結(jié)oftheseeond田九PlifieationofrdeetetionofHAVvirionPositiveRT一PCR.M，DNAmarkerDLZ，000.Lnaes:8，undilutedsmaPle代Ins夕mlorHAv:7一l，seria一10一幾一ddi一utions.Aorrwdenoetrdouest.異ulstofhetfisrtnalPlificationofrdeetctinoofHAVvirion結(jié)Positivespeeifie盯一陀R.Lnaes:8，undi一ut“masp一econatini飛afHAV;7一l，serial10一oflddiltllions.M12345678
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R373

【共引文獻】

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本文編號：2624856