【摘要】：胰島素基因治療是利用分子生物學技術,將體外構建的能夠在體內表達胰島素的人造基因轉移至在糖尿病病人體內特定的細胞內,使之長期保留并表達胰島素的一種實驗性治療手段。如何安全、持續(xù)、穩(wěn)定地將胰島素基因轉移至活體細胞內并能合理地按需調控其表達等是胰島素基因治療仍沒能解決的核心技術問題。骨骼肌被視為基因治療中目的基因表達的良好載體,有如下優(yōu)點:①體塊巨大、部位表淺、容易操作;②血運豐富、蛋白質產生后能迅速入血;③作為永久性細胞沒有分裂能力,細胞數(shù)目不變,使外源基因易于在細胞核內長期保留、其數(shù)目不會發(fā)生增減;④細胞間有融合性、外源基因較易向周圍的肌肉細胞內擴散、轉移效率高;⑤質粒作為基因轉移的載體具有不含病毒、安全性好,構建容易、能夠大量制備,治療效果不受重復注射次數(shù)的影響等優(yōu)點。但是,就胰島素基因治療而言,肌肉缺乏血糖調控的基因啟動子,胰島素持續(xù)分泌可能會引起致命的低血糖。重組四環(huán)素耐藥基因操縱子系統(tǒng)能夠在真核細胞表達,通過這一系統(tǒng)人們能夠調控外源基因在體內的表達。因此,利用四環(huán)素操縱子表達系統(tǒng)質粒調控骨骼肌胰島素基因的表達應該是可行的。 目的 構建強力霉素調控的胰島素基因表達載體,驗證其在成肌細胞內受強力霉素調控后的表達情況;研究該質粒在骨骼肌注射后對鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病小鼠血糖的控制作用及電穿孔對該質粒肌內注射后轉導效率的影響,探討通過調控該質粒體內表達來調節(jié)血糖水平的可行性。 方法 1.強力霉素調控的胰島素基因表達質粒的構建及其在體外成肌細胞內的表達調控 (1)構建ptet-mINS 分別用BamHI和ClaI酶切pUHG102-8質粒和pINS-ABC質粒,將胰島素原基因片段定向克隆到pUHG102-8質粒的四環(huán)素耐藥基因啟動子下游,得到ptet-mINS質粒,并用BamHI和ClaI酶切鑒定插入序列的準確性。 WP=5 (2)構建prTA-tet4-mINS 用XhoI和HindIII酶切prtTA2-1質粒,將得到的PhCMV-rtTA2-1/poly(A)片段插入到經XhoI酶切的ptet-mINS質粒,得到prTA-tet4-mINS質粒。 (3)建成prTA-tet4-rhINS 用ScaI和BamHI酶切pLNCX質粒,將所得到的無功能5’LTR-(+-Neor片段插入到經XhoI酶切的prTA-tet4-mINS上得到最終的prTA-tet4-rhINS質粒。直接測序其正確無誤。 (4)質粒導入成肌細胞系 用脂質體轉移法將prTA-tet4-rhINS和pLNCX(一種含有新霉素抗性基因,但不含胰島素基因的逆轉錄病毒基因克隆、表達質粒)導入同一成肌細胞系(C2C12)細胞內。經氨基糖苷(G418,一種新霉素類似物)篩選后,以不同濃度(0(g/ml、2(g/ml及10(g/ml)的強力霉素(Dox)誘導成活細胞,檢測誘導后第1、3、5、7天及撤藥后第1,3及5天培養(yǎng)基和細胞提取物的胰島素(原)水平。留取第5天培養(yǎng)的細胞進行胰島素原mRNA檢測。用放射免疫分析(RIA)測定胰島素(原)水平。C2C12細胞內人胰島素原mRNA用反轉錄-多聚酶鏈反應技術(RT-PCR)檢測。 2.骨骼肌注射的prTA-tet4-rhINS對不同種系STZ糖尿病小鼠血糖的作用 ①用大腸桿菌擴增、堿裂解法提取及聚乙二醇法純化質粒prTA-tet4-rhINS和pLNCX;②腹腔內注射STZ(150mg/kg)制備Balb/C和昆明種小鼠糖尿病模型(血糖≥16.7 mmol/L,持續(xù)2周以上);③經皮向小鼠雙側后腿骨骼肌內各注射prTA-tet4-rhINS質粒150μg,共300μg(治療組),注射pLNCX質粒者為對照組,同時使小鼠分別飲服濃度為0.5g/L和2g/L的Dox水,尾尖取血,測定每日上午8時隨機血糖(葡萄糖氧化酶試紙法),并稱量小鼠體重;④血糖穩(wěn)定下降的第6天,斷頭處死部分小鼠,留取全血、注射部位的骨骼肌及肝臟組織,測定血清人胰島素(RIA)和C肽(免疫放射定量分析,IRMA)水平以及注射部位小鼠骨骼肌人胰島素原mRNA(RT-PCR)。 3.電穿孔技術prTA-tet4-rhINS肌肉轉導和降血糖的增強作用 ①制備昆明小鼠糖尿病模型(方法同前)。②分單純肌肉注射prTA-tet4-rhINS組(單純注射組,48只)、肌肉注射prTA-tet4-rhINS后電穿孔增強組(電穿孔組,42只)和肌肉注射pLNCX后電穿孔增強組(對照組,35只),注射質粒劑量相同(肌肉注射方法同前),同時飲服濃度為2g/L的Dox水。監(jiān)測鼠尾末梢血糖(方法同前)和小鼠體重。③于血糖穩(wěn)定下降的第14天,對部分小鼠摘眼球取血并留取肝臟、注射部位肌肉。測定血清中人真胰島素(ELISA)水平及小鼠肌肉組織中人胰島素原基因mRNA(RT-PCR)。④觀察部分對照組小鼠、電穿孔組血糖控制穩(wěn)定的小鼠及正常小鼠,在飲服進而撤除Dox水(2g/L)過程中及在持續(xù)飲服Dox水(2g/L)的情況下,空腹24小時內其血糖水平的變化情況。 WP=6 結果 1.強力霉素調控的胰島素基因表達質粒的構建及其在體外成肌細胞內的表達調控 ①直接測序結果顯示prTA-tet4-rhINS質粒的胰島素基因片段插入方向及核酸順序與預計的完全一致;②RT-PCR結果顯示此質粒能在C2C12細胞內表達;③細胞培養(yǎng)液中的胰島素水平在加藥24小時后開始增加,至第7天接近達平臺,撤藥后迅速下降,撤藥后第5天降至基礎水平。④培養(yǎng)基內加入不同濃度強力霉素,其胰島素產量明顯不同,10μg/ml時培養(yǎng)基內的胰島素水平(23.32(1.47mIU/L)明顯較2μg/ml時(13.29(1.40mIU/L)高(p0.05)。細胞內和培養(yǎng)基中的胰島素水平無明顯差異(p0.05),細胞內胰島素水平在Dox為10μg/ml時和2μg/ml時分別為23.8
【圖文】：

ab胰島素放免分析試劑盒購自中國北京中國原子能研究所(批內 CV＝6.73％， CV＝9.29%)；引物由寶生物工程（大連）有限公司合成；JM109 感受態(tài)大腸、凝膠回收試劑盒、RNA 提取試劑盒（Catrimox-14 RNA Isolation Kit, ver2.11）相關的 DNA 限制性內切酶、Taq 酶、DL-2000，λ-HindⅢ分子量標樣、逆轉多聚酶鏈反應（RT-PCR）相關的試劑盒（TakaRa RNA PCR kit (AMV) ver 2.1）基焦磷酰胺水（diethyl pyrocarbonate，，DEPC）均購自寶生物工程（大連）有司。Trizol 試劑購自美國 Invitrogen 公司；其他相關試劑均系國產分析純或電試劑。試劑的具體配制見附錄。

構建胰島素基因表達調控質粒時所用的無功能插入片的強力霉素調控的胰島素基因表達質粒（prTA-tet4-r插入序列來自該質粒的 ScaI 和 BamHI 酶切后的較小序列中含有新霉素抵抗基因（Neor），不含胰島素基因因，LTR 為長末端重復序列，PhCMV IE 巨細胞病毒立美國 PE 公司），PCR 儀（美國 PE 公司）等本日立公司），DHP-9002 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（DSHZ-300 多用途水浴恒溫震蕩器（中國江蘇儀（中國大連捷邁科貿有限公司）。50ml 培養(yǎng)瓶）。隔水式恒溫培養(yǎng)箱（中國湖北黃石醫(yī)療儀器司），TY92－II 型超聲波細胞粉碎機（中國寧
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻】

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1 李鴻,蘇本利;糖尿病基因治療的新進展[J];生物化學與生物物理進展;2003年01期

2 李鴻,蘇本利,劉海霞,張雪揚,呂申,劉敏,紀曉,F.BOSCH;肌肉注射可調控胰島素基因對糖尿病小鼠降糖作用[J];生物化學與生物物理進展;2004年03期

3 楊郁,李昌臣,李躍,馬郁芳,白然,杜建玲,朱佩錦,谷玲;體內直接人胰島素原基因轉移對糖尿病小鼠治療作用的研究[J];中國糖尿病雜志;2002年06期

4 白然,李昌臣,李躍,馬郁芳,陳磊,谷玲;人胰島素原基因在體外培養(yǎng)的NIH3T3細胞中的基因轉移和表達的研究[J];中華內分泌代謝雜志;2000年01期

5 沈坤堂 ,秦新裕 ,肖華勝 ,張新 ,許相儒 ,韓澤廣;基因工程改造非β細胞分泌成熟胰島素的研究(英文)[J];Chinese Medical Journal;2002年04期

6 張國華,沈冬,金彩科,譚小凡,陳光慧,湯健;電脈沖介導基因轉移效率的實驗研究[J];中華醫(yī)學雜志;2001年15期

本文編號：2624780