【摘要】：胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell,簡(jiǎn)稱(chēng)ES細(xì)胞)具有的自我更新、多潛能性等特性,使其具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。ES細(xì)胞狀態(tài)的維持受相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,現(xiàn)已知在小鼠ES細(xì)胞中,最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是LIF/STAT3、BMP4和WNT通路；Oct4、Sox2和Nanog是小鼠ES細(xì)胞維持自我更新的三個(gè)核心因子。MicroRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度～22nt的非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá),現(xiàn)已證明其在生命過(guò)程的各個(gè)方面行使功能。MicroRNA對(duì)ES細(xì)胞狀態(tài)的維持也發(fā)揮著重要調(diào)控作用,現(xiàn)已知多種microRNA影響ES細(xì)胞的自我更新和分化潛能；對(duì)成熟microRNA生成具有關(guān)鍵作用的dgcr8被敲除的ES細(xì)胞表現(xiàn)出分化功能缺陷：在成體細(xì)胞重編程過(guò)程中引入或者抑制某種microRNA的表達(dá)能提高iPS細(xì)胞的形成效率。目前對(duì)以ESCC (ES cell-specific cell cycle)類(lèi)microRNA為代表的促進(jìn)ES細(xì)胞自我更新的nicroRNA的研究較為廣泛,而對(duì)于促進(jìn)ES細(xì)胞分化的microRNA研究相對(duì)較少,因此我們擬系統(tǒng)性地篩選能夠促進(jìn)ES細(xì)胞分化的rnicroRNA,并研究其在調(diào)控ES細(xì)胞自我更新及分化過(guò)程中的作用,并對(duì)這些nicroRNA促進(jìn)ES細(xì)胞分化的內(nèi)在分子機(jī)制進(jìn)行闡述。 首先我們對(duì)microRNA在ES細(xì)胞和已分化細(xì)胞中的表達(dá)譜,以及靶向ES細(xì)胞自我更新維持重要轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、c-myc、Rex1、 Sall4、Stella和Lin28)的microRNA進(jìn)行整體評(píng)估,篩選出40個(gè)可能促進(jìn)ES細(xì)胞分化的候選microRNA;隨后我們?cè)跓o(wú)內(nèi)源性nicroRNA表達(dá)的dgcr8-/-ES細(xì)胞中對(duì)這些候選microRNA進(jìn)行功能驗(yàn)證,主要包括克隆形成實(shí)驗(yàn)、堿性磷酸酶染色、Oct4免疫熒光、細(xì)胞周期、ES細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下基因表達(dá)譜變化等實(shí)驗(yàn),我們將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估,得到以let-7c、miR-129、miR-9、miR-124、miR-24為代表的15個(gè)在dgcr8-/-ES細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著抑制ES細(xì)胞自我更新和促分化能力的microRNA,其中l(wèi)et-7c、miR-300、miR-24、miR-27a、miR-124、miR-27b和miR-129在有內(nèi)源microRNA表達(dá)的野生型ES細(xì)胞中也表現(xiàn)出一定促分化的能力。 進(jìn)而,我們對(duì)產(chǎn)生于同一個(gè)基因簇位置上的miR-27a和miR-24進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究和機(jī)制探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-27a和miR-24在分化細(xì)胞和組織中高表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-27a和miR-24能顯著抑制dgcr8/-ES細(xì)胞的自我更新,并促進(jìn)ES細(xì)胞向各胚層不同程度分化；該基因簇受c-myc的負(fù)調(diào)控,分化過(guò)程中c-myc的下降會(huì)誘導(dǎo)miR-27a和miR-24的表達(dá)上升；miR-27a和miR-24靶向ES細(xì)胞重要轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Oct4、Foxol、gp130、Smad3和Smad4,ES細(xì)胞在分化過(guò)程中這些因子的表達(dá)下降進(jìn)而導(dǎo)致c-myc的低表達(dá),促使miR-27a和miR-24的表達(dá)進(jìn)一步提高,從而在分化過(guò)程中形成了一個(gè)負(fù)饋調(diào)節(jié)通路,促使ES細(xì)胞不斷走向分化。此外,我們發(fā)現(xiàn)在Oct4、Sox2、Klf4三因子誘導(dǎo)重編程的條件下同時(shí)抑制miR-27a或miR-24的表達(dá)能顯著提高iPS細(xì)胞形成效率,且誘導(dǎo)出的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有全能型。 在該研究中,我們對(duì)促ES細(xì)胞分化的microRNA進(jìn)行了一次全面功能性的篩選,發(fā)現(xiàn)多個(gè)明顯促進(jìn)ES細(xì)胞分化的microRNA,并對(duì)其中表現(xiàn)顯著的miR-27a和miR-24進(jìn)行了深入的功能和分子機(jī)制研究,闡明了在ES細(xì)胞分化過(guò)程中microRNA調(diào)控的可能機(jī)制,這對(duì)于ES細(xì)胞的分化研究有著重要的參考價(jià)值。
【圖文】：

圖1 V6.5和ESI在feeder-free培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞形態(tài)觀察A.V6.5和ES1在M15+UF培養(yǎng)基中生長(zhǎng)形態(tài)圖，，圖示為200x顯微鏡觀察結(jié)果。B. V6.5和ES1免疫勞光染色結(jié)果，于單細(xì)胞水平上觀察0ct4、Nanog和SSEA1的表達(dá)情況，圖不■為200x滅光顯微鏡觀察結(jié)果。A Embryoid bodies lOd B Cell cycle?.?11 “ 3 mm mi If n> ..-,！‘^ n -I：：：；—,- J G1。/。=21- ’ S%=66 7漏，k —:a tt m n* tm m ?* ittI w?a>?w.u??uu? SSLt."U? . ^^ i G1%=36.6V jSSfc S

本文編號(hào)：2622474