發(fā)布時間：2020-04-10 16:49

【摘要】：胚胎干細胞(Embryonic Stem Cell,簡稱ES細胞)具有的自我更新、多潛能性等特性,使其具有廣泛的應用價值。ES細胞狀態(tài)的維持受相關信號轉(zhuǎn)導通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,現(xiàn)已知在小鼠ES細胞中,最重要的信號轉(zhuǎn)導通路是LIF/STAT3、BMP4和WNT通路；Oct4、Sox2和Nanog是小鼠ES細胞維持自我更新的三個核心因子。MicroRNA是一類長度～22nt的非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種基因的表達,現(xiàn)已證明其在生命過程的各個方面行使功能。MicroRNA對ES細胞狀態(tài)的維持也發(fā)揮著重要調(diào)控作用,現(xiàn)已知多種microRNA影響ES細胞的自我更新和分化潛能；對成熟microRNA生成具有關鍵作用的dgcr8被敲除的ES細胞表現(xiàn)出分化功能缺陷：在成體細胞重編程過程中引入或者抑制某種microRNA的表達能提高iPS細胞的形成效率。目前對以ESCC (ES cell-specific cell cycle)類microRNA為代表的促進ES細胞自我更新的nicroRNA的研究較為廣泛,而對于促進ES細胞分化的microRNA研究相對較少,因此我們擬系統(tǒng)性地篩選能夠促進ES細胞分化的rnicroRNA,并研究其在調(diào)控ES細胞自我更新及分化過程中的作用,并對這些nicroRNA促進ES細胞分化的內(nèi)在分子機制進行闡述。 首先我們對microRNA在ES細胞和已分化細胞中的表達譜,以及靶向ES細胞自我更新維持重要轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、c-myc、Rex1、 Sall4、Stella和Lin28)的microRNA進行整體評估,篩選出40個可能促進ES細胞分化的候選microRNA;隨后我們在無內(nèi)源性nicroRNA表達的dgcr8-/-ES細胞中對這些候選microRNA進行功能驗證,主要包括克隆形成實驗、堿性磷酸酶染色、Oct4免疫熒光、細胞周期、ES細胞正常培養(yǎng)條件下基因表達譜變化等實驗,我們將實驗結(jié)果進行綜合評估,得到以let-7c、miR-129、miR-9、miR-124、miR-24為代表的15個在dgcr8-/-ES細胞中表現(xiàn)出顯著抑制ES細胞自我更新和促分化能力的microRNA,其中l(wèi)et-7c、miR-300、miR-24、miR-27a、miR-124、miR-27b和miR-129在有內(nèi)源microRNA表達的野生型ES細胞中也表現(xiàn)出一定促分化的能力。 進而,我們對產(chǎn)生于同一個基因簇位置上的miR-27a和miR-24進行進一步的功能研究和機制探討。實驗結(jié)果顯示：miR-27a和miR-24在分化細胞和組織中高表達,過表達miR-27a和miR-24能顯著抑制dgcr8/-ES細胞的自我更新,并促進ES細胞向各胚層不同程度分化；該基因簇受c-myc的負調(diào)控,分化過程中c-myc的下降會誘導miR-27a和miR-24的表達上升；miR-27a和miR-24靶向ES細胞重要轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導分子Oct4、Foxol、gp130、Smad3和Smad4,ES細胞在分化過程中這些因子的表達下降進而導致c-myc的低表達,促使miR-27a和miR-24的表達進一步提高,從而在分化過程中形成了一個負饋調(diào)節(jié)通路,促使ES細胞不斷走向分化。此外,我們發(fā)現(xiàn)在Oct4、Sox2、Klf4三因子誘導重編程的條件下同時抑制miR-27a或miR-24的表達能顯著提高iPS細胞形成效率,且誘導出的誘導多能干細胞具有全能型。 在該研究中,我們對促ES細胞分化的microRNA進行了一次全面功能性的篩選,發(fā)現(xiàn)多個明顯促進ES細胞分化的microRNA,并對其中表現(xiàn)顯著的miR-27a和miR-24進行了深入的功能和分子機制研究,闡明了在ES細胞分化過程中microRNA調(diào)控的可能機制,這對于ES細胞的分化研究有著重要的參考價值。
【圖文】：

圖1 V6.5和ESI在feeder-free培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞形態(tài)觀察A.V6.5和ES1在M15+UF培養(yǎng)基中生長形態(tài)圖，，圖示為200x顯微鏡觀察結(jié)果。B. V6.5和ES1免疫勞光染色結(jié)果，于單細胞水平上觀察0ct4、Nanog和SSEA1的表達情況，圖不■為200x滅光顯微鏡觀察結(jié)果。A Embryoid bodies lOd B Cell cycle?.?11 “ 3 mm mi If n> ..-,！‘^ n -I：：：；—,- J G1。/。=21- ’ S%=66 7漏，k —:a tt m n* tm m ?* ittI w?a>?w.u??uu? SSLt."U? . ^^ i G1%=36.6V jSSfc S

本文編號：2622474