【摘要】：單純皰疹病毒(HSV)是一種具有較強傳染性的病原體，它是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雙鏈DNA病毒，在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程中與宿主細(xì)胞之間表現(xiàn)有多種相互作用。HSV與受體的相互作用所導(dǎo)致的細(xì)胞基因反應(yīng)是研究HSV感染不同細(xì)胞后會形成不同的感染過程及結(jié)果的基礎(chǔ)。從這個意義上說，對于病毒結(jié)合受體所導(dǎo)致的細(xì)胞早期基因反應(yīng)的分析，在探索細(xì)胞對病毒感染產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)的機(jī)理，和由此機(jī)理所導(dǎo)致的各種可能的生物學(xué)意義而確定的臨床治療或診斷方法等領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用都具有很大的意義。 本實驗的研究重點是分析病毒感染誘導(dǎo)的差異基因所編碼蛋白在細(xì)胞內(nèi)的功能意義，通過HSV-1型病毒刺激KMB-17細(xì)胞后，進(jìn)行差異顯示分析，根據(jù)分析結(jié)果，克隆得到了一個差異基因，命名為HSV-1刺激相關(guān)基因(HSV-1 stimulation related gene 1，hsrg1)，經(jīng)GenBank檢索為一未知功能編碼基因，全長1748bp，CDS全長為1641bp，我們將該基因克隆到谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)載體(pGEX-5x-1)中，構(gòu)建了pGEX-HSRG1表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21中獲得了較高的表達(dá)，并采用Glutathione Sepharose4B進(jìn)行親和純化，獲得較高純度的目的蛋白，用該蛋白免疫小鼠后制備的特異抗體，蛋白印跡實驗表明原核表達(dá)的HSRG1能被該抗體特異識別。該抗體在病毒刺激KMB-17細(xì)胞前后的免疫沉淀實驗(IP)中亦表現(xiàn)出較好的特異性，顯示我們所表達(dá)的HSRG1蛋白具有與天然蛋白相同的構(gòu)象。多組織mRNA表達(dá)譜分析表明，hsrg1基因在骨骼肌、腦、心臟、皮膚等組織中有表達(dá)。 免疫沉淀實驗(IP)的結(jié)果進(jìn)一步證實了HSV-1刺激可使HSRG1蛋白的表達(dá)量明顯增加；且該蛋白質(zhì)能夠被磷酸化。通過對HSRG1-EGFP融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)觀察，初步確定HSRG1定位于細(xì)胞漿內(nèi)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，hsrg1編碼的蛋白質(zhì)屬于一個功能未明的SAND蛋白家族的成員，其中含有一個存在于多種真核生物中的保守的結(jié)構(gòu)域。hsrg1基因定位于人染色體16q23.1臂上，5個外顯子分布于約7kb范圍內(nèi)。 轉(zhuǎn)染pcDNA-HSRG1的KMB-17細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞感染HSV-1后，兩者的病毒滴度無明顯變化，提示HSRG1蛋白表達(dá)量增加對HSV-1病毒的感染和復(fù)制無直接影響；利用RNAi技術(shù)將約400bp的dsRNA轉(zhuǎn)入KMB-17細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，，實驗組和對照組的細(xì)胞周期無明顯差別。利用酵母雙雜交系統(tǒng)初步確定，SV40的T抗原可以和HSRG1發(fā)生相互作用，并通過免疫共沉淀實驗在細(xì)胞內(nèi)證實這種相互作用的存在。 通過對HSRG1蛋白功能的初步研究并結(jié)合Internet及生物信息技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析整理，我們
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hsgrl全基因的獲得我們選取差異條帶，將獲得的差異顯示片段切下后，再次進(jìn)行CPR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖10，經(jīng)狹縫印跡雜交，利用差異片段制備的探針在上述cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)一個eds全長為1748，ORF為1641bp的基因，命名為hsrgl(HSv一1stimulati。n

圖11hsrgl序列測定FigllSequeneingofhsrgl董濘時蔗之君綸必帶有Ec0RI位點的引物對克隆在pUC18中的hsrgl基因的完整ORF進(jìn)行CPR擴(kuò)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖12。在小于2000bp處均擴(kuò)增出hsgrl的特異條帶。MPb姍攢撰ooI圖12HSRGI基因PCR擴(kuò)增
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R373

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 劉龍丁,董承紅,董少忠,王麗春,胡方,趙紅玲,李琦涵;HSV-1感染細(xì)胞中HTRP基因的克隆及表達(dá)純化[J];病毒學(xué)報;2003年01期

2 李凌云,齊義鵬,渡邊倫子,上田重晴;控制麻疹病毒血凝集性的重要功能位點[J];科學(xué)通報;1999年01期

3 李琦涵,董承紅,王炯,王麗春,孫明,楊芳;兩種病毒與細(xì)胞結(jié)合誘導(dǎo)的原癌基因早期表達(dá)[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報;2000年02期

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本文編號：2622282