【摘要】：目的：構(gòu)建小鼠成熟自然殺傷T（Natural killer T，NKT）細(xì)胞來源的誘導(dǎo)型多潛能干細(xì)胞（NKT-induced pluripotent stem cell，NKT-iPSC）克隆小鼠，通過體內(nèi)實驗探討NKT細(xì)胞命運是否由T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）α鏈或α鏈和β鏈的基因重組決定，并為NKT細(xì)胞發(fā)育和功能的體內(nèi)研究提供更有效的動物模型。 本研究應(yīng)用由WT C57BL/6（B6）小鼠成熟NKT細(xì)胞重編程獲得的NKT-iPSC，成功構(gòu)建了兩種NKT-iPSC克隆小鼠，分別為已重組Vα14基因和野生型Vβ基因的Vα14/WTVβ小鼠及已重組Vα14基因和已重組Vβ7基因的Vα14/Vβ7小鼠。 利用流式細(xì)胞術(shù)對兩種NKT-iPSC克隆小鼠胸腺、脾臟和肝臟NKT細(xì)胞數(shù)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)兩種NKT-iPSC克隆小鼠三種器官NKT細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組小鼠（B6小鼠）。流式細(xì)胞術(shù)和qPCR結(jié)果顯示，NKT細(xì)胞發(fā)育相關(guān)因子CD1d、Ly108、SAP、Fyn、Myb、Myc、Runx1、HEB及Egr2在NKT-iPSC克隆小鼠胸腺CD4/CD8雙陽性細(xì)胞（NKT前體細(xì)胞所在細(xì)胞群）中表達(dá)水平與在B6小鼠中無顯著區(qū)別。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，兩種NKT-iPSC克隆小鼠胸腺、脾臟和肝臟中CD4-IL-17RB+、CD4+IL-17RB+以及IL-17RB-NKT亞群細(xì)胞數(shù)均高于B6小鼠。體外利用PMA刺激NKT細(xì)胞后，通過細(xì)胞內(nèi)熒光染色法檢測IFNγ＋、IL-4＋及IL-17A＋NKT細(xì)胞的比率和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)Vα14/WTVβ小鼠3種器官中產(chǎn)生IFNγ、IL-4和IL-17A的NKT細(xì)胞數(shù)均顯著高于B6小鼠；而Vα14/Vβ7小鼠體內(nèi)產(chǎn)生IL-4和IL-17A的NKT亞群細(xì)胞數(shù)在胸腺中明顯少于B6小鼠，但在脾臟和肝臟中顯著高于B6小鼠。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測未成熟標(biāo)記CD24和CD62L在NKT-iPSC克隆小鼠胸腺及肝臟NKT細(xì)胞表面的表達(dá)，結(jié)果顯示Vα14/Vβ7小鼠胸腺NKT細(xì)胞表面大量表達(dá)CD24和CD62L，而肝臟NKT細(xì)胞表面這兩個標(biāo)志物的表達(dá)則明顯減低，提示Vα14/Vβ7小鼠體內(nèi)NKT細(xì)胞在外周免疫器官中獲得了功能的成熟。對兩種克隆小鼠體內(nèi)其他免疫細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，在NKT-iPSC克隆小鼠體內(nèi)無γδT細(xì)胞以及CD4T細(xì)胞的發(fā)育受影響數(shù)量減少，而CD8T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞均正常發(fā)育。 本實驗應(yīng)用由B6小鼠成熟NKT細(xì)胞重編程獲得的NKT-iPSC，成功構(gòu)建了兩種NKT-iPSC克隆小鼠。通過對兩種NKT-iPSC克隆小鼠體內(nèi)NKT細(xì)胞數(shù)量、發(fā)育、功能和成熟，以及其他免疫細(xì)胞發(fā)育的檢測，證明TCR Vα14而非Vβ7基因的重組決定NKT細(xì)胞命運。此外，本研究可以證明NKT-iPSC克隆小鼠擁有較完全及發(fā)育正常的免疫系統(tǒng)，更利于NKT細(xì)胞發(fā)育和功能的體內(nèi)研究。
【圖文】：

-iPSC 克隆小鼠的構(gòu)建體小鼠（chimera mouse）的構(gòu)建和鑒定-iPSC 細(xì)胞注射入雌性 BALB/c 小鼠的囊胚，從該 BALB/c 小鼠所生毛色辨別得到 2 只嵌合毛色小鼠，分別命名為 iPSC-58 3E7-1 和-2。R 方法對其 TCR 基因型進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示兩只小鼠均可見野生型α條帶及已重組（Rearranged）TCRα條帶（左）及 WT 和 Rearranged右），而對照B6小鼠則只可見WT TCRα及TCRβ條帶而無Rearranged 3.1 所示。因此確定小鼠 iPSC-58 3E7-1 及 iPSC-58 3E7-2 的 TCR 基α14+/-Vβ7+/-。A!B!TCR! locus! TCR# locus!WT! Rearranged!E7-13E7-23!E7-13E7-23!WT! Rearranged!E7-13E7-23!E7-13E7-23!TCR! locus!V!14 Rearranged!

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文根據(jù)小鼠基因型，將這些后代小鼠配對進(jìn)行數(shù)次交配基因型分別為 Vα14+/+WTVβ及 Vα14+/+Vβ7+/+兩種純合子（NKT-iPSC-derived mouse），，分別命名為 Vα14/WTVβ小鼠B!TCR# locus!WT! Rearranged!E7-13E7-23!E7-13E7-23!TCR! locus! TCR# locus!V!14 Rearranged!V#7 Rearranged!-318bp!
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363

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本文編號：2621932