【摘要】：【研究背景】 醛糖還原酶（Aldose reductase，AR）是糖代謝中多元醇通路的限速酶，負責將葡萄糖轉化成山梨醇。但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，AR的作用并不僅僅局限于糖代謝過程，它還被視為介導多種炎癥性疾病的靶分子。許多實驗證實，AR抑制劑（AR inhibitor，ARI）可以有效地抑制炎癥反應，而過表達AR會增強固有免疫反應。據(jù)報道，AR可能通過NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路調控炎癥反應，但是機制尚不明確。 經(jīng)典NF-κB信號通路在固有免疫反應中發(fā)揮非常關鍵的作用，通過調控促炎細胞因子轉錄，募集并活化炎癥細胞來執(zhí)行炎癥反應。經(jīng)典NF-κB信號途徑依賴IKKβ，IKKβ存在于一個與IKKα和IKKγ密切相關的復合體中。炎癥刺激活化IKKβ，后者使IκBα泛素化降解，最終激活NF-κB信號通路，啟動炎癥相關基因轉錄。 自噬（Autophagy）是指胞漿內的雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解的蛋白質、細胞器和病原體等成分形成自噬體（Autophagosome），并與溶酶體融合形成自噬溶酶體（Autolysosome），降解其所包裹的內容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新及清除入侵的病原體。微管相關蛋白輕鏈3（MAP-LC3），包括I型和II型，II型由其前體I型切掉羧基端30個氨基酸后與磷脂酰乙醇胺（PE）連接而形成。LC3II參與自噬泡膜的成熟過程并分布于膜的兩側，因此，通常把它作為成熟自噬泡的標記物。選擇性自噬是指游離膜結構識別并包裹胞質內的特定底物形成自噬體，并將其降解，比如蛋白聚合物自噬。自噬對蛋白聚合物的降解需要泛素及p62/SQSTM1（Sequestosome1）的參與。p62作為自噬受體，含有泛素相關結構域（Ubiquitin-associated domain， UBA)，識別并結合K63-聚泛素化的底物（K63-polyubiquitinated substrates），然后進一步與泛素樣蛋白（Ubiquitin-like protein）LC3結合，從而使底物進入自噬降解途徑。 近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬與固有免疫反應有著廣泛的相互調控作用。一方面，固有免疫信號可以誘導或抑制自噬，自噬是固有免疫的重要組成成分，在抗胞內病原體感染中發(fā)揮效應器（Effector）作用，最終通過溶酶體降解被自噬體包裹的病原體。另一方面，自噬也參與眾多固有免疫信號的調控，然而具體的機制依然不清。 我們前期研究發(fā)現(xiàn)：AR參與脊髓損傷后巨噬/小膠質細胞的極化過程；同時我們體外預實驗發(fā)現(xiàn)，LPS誘導的AR缺陷（AR knock-out或者knock-down）巨噬細胞的iNOS表達量較AR正常組低，而自噬水平（LC3II/LC3I）較AR正常組高。那么AR，自噬和固有免疫反應這三者之間有著怎樣的聯(lián)系呢？ 【目的】 研究AR，自噬和固有免疫反應之間的相互關系，闡明AR對固有免疫反應的調控機制。 【方法】 1)培養(yǎng)細胞：野生型（Wide type，WT）和AR敲除型（AR knock-out，AR KO）C57BL/6J小鼠骨髓來源的巨噬細胞（BMDMs）和來源于小鼠巨噬細胞瘤的RAW264.7細胞系。 2)設計AR siRNA，轉染到RAW264.7細胞，，并評價效果。 3)體外模擬炎癥反應，提總蛋白，western blot檢測各組經(jīng)典NF-κB信號通路上下游的關鍵分子TLR4，IKKβ，IKKγ，IκBα，p62和iNOS，發(fā)現(xiàn)LPS誘導的AR缺陷（AR knockout或者knockdown）組IKKβ和IKKγ蛋白水平較AR正常組低。 4)提總mRNA，qPCR檢測各組IKKβ和IKKγ mRNA水平，發(fā)現(xiàn)LPS誘導的AR缺陷組IKKβ和IKKγ mRNA水平和對照組并沒有差異，說明LPS誘導的AR缺陷巨噬細胞的IKKβ和IKKγ蛋白降低發(fā)生在轉錄后水平。 5)爬片，免疫組化觀察各組LC3（自噬體Marker）和LAMP1（溶酶體Marker）標記的巨噬細胞，了解AR缺陷對自噬體形成和成熟的影響；提總蛋白，westernblot檢測各組LC3和LAMP1蛋白水平；收集細胞，制超薄切片，透射電鏡觀察各組自噬體和自噬溶酶體。 6)爬片，免疫組化觀察各組IKKβ、IKKγ分別與LC3和LAMP1的共標情況。 7)爬片，免疫組化觀察各組IKKβ、IKKγ分別與泛素（Ub）和p62的共標情況。 8)用3-MA阻斷自噬，提總蛋白，western blot檢測各組LC3，IKKβ，IKKγ和iNOS的變化。 【結論】 1）AR缺陷對固有免疫反應的抑制是由于經(jīng)典NF-κB信號通路中的IKK復合體（IKKβ和IKKγ）在轉錄后水平被降解； 2）AR缺陷可以誘發(fā)自噬體形成，LPS刺激會進一步促進自噬體形成和自噬體成熟； 3）LPS誘導的巨噬細胞的IKKβ和IKKγ廣泛地與自噬體和溶酶體結合； 4）LPS誘導的巨噬細胞的IKKβ和IKKγ廣泛地泛素化并被p62識別結合； 5）藥物阻斷自噬后，IKK復合體的蛋白水平和iNOS表達水平顯著增高。綜上所述，可以得出結論，AR缺陷通過激活自噬途徑抑制固有免疫反應。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2621790