【摘要】：【研究背景】 醛糖還原酶（Aldose reductase，AR）是糖代謝中多元醇通路的限速酶，負(fù)責(zé)將葡萄糖轉(zhuǎn)化成山梨醇。但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，AR的作用并不僅僅局限于糖代謝過程，它還被視為介導(dǎo)多種炎癥性疾病的靶分子。許多實驗證實，AR抑制劑（AR inhibitor，ARI）可以有效地抑制炎癥反應(yīng)，而過表達(dá)AR會增強固有免疫反應(yīng)。據(jù)報道，AR可能通過NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路調(diào)控炎癥反應(yīng)，但是機制尚不明確。 經(jīng)典NF-κB信號通路在固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，通過調(diào)控促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，募集并活化炎癥細(xì)胞來執(zhí)行炎癥反應(yīng)。經(jīng)典NF-κB信號途徑依賴IKKβ，IKKβ存在于一個與IKKα和IKKγ密切相關(guān)的復(fù)合體中。炎癥刺激活化IKKβ，后者使IκBα泛素化降解，最終激活NF-κB信號通路，啟動炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。 自噬（Autophagy）是指胞漿內(nèi)的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和病原體等成分形成自噬體（Autophagosome），并與溶酶體融合形成自噬溶酶體（Autolysosome），降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新及清除入侵的病原體。微管相關(guān)蛋白輕鏈3（MAP-LC3），包括I型和II型，II型由其前體I型切掉羧基端30個氨基酸后與磷脂酰乙醇胺（PE）連接而形成。LC3II參與自噬泡膜的成熟過程并分布于膜的兩側(cè)，因此，通常把它作為成熟自噬泡的標(biāo)記物。選擇性自噬是指游離膜結(jié)構(gòu)識別并包裹胞質(zhì)內(nèi)的特定底物形成自噬體，并將其降解，比如蛋白聚合物自噬。自噬對蛋白聚合物的降解需要泛素及p62/SQSTM1（Sequestosome1）的參與。p62作為自噬受體，含有泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（Ubiquitin-associated domain， UBA)，識別并結(jié)合K63-聚泛素化的底物（K63-polyubiquitinated substrates），然后進一步與泛素樣蛋白（Ubiquitin-like protein）LC3結(jié)合，從而使底物進入自噬降解途徑。 近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬與固有免疫反應(yīng)有著廣泛的相互調(diào)控作用。一方面，固有免疫信號可以誘導(dǎo)或抑制自噬，自噬是固有免疫的重要組成成分，在抗胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮效應(yīng)器（Effector）作用，最終通過溶酶體降解被自噬體包裹的病原體。另一方面，自噬也參與眾多固有免疫信號的調(diào)控，然而具體的機制依然不清。 我們前期研究發(fā)現(xiàn)：AR參與脊髓損傷后巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的極化過程；同時我們體外預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的AR缺陷（AR knock-out或者knock-down）巨噬細(xì)胞的iNOS表達(dá)量較AR正常組低，而自噬水平（LC3II/LC3I）較AR正常組高。那么AR，自噬和固有免疫反應(yīng)這三者之間有著怎樣的聯(lián)系呢？ 【目的】 研究AR，自噬和固有免疫反應(yīng)之間的相互關(guān)系，闡明AR對固有免疫反應(yīng)的調(diào)控機制。 【方法】 1)培養(yǎng)細(xì)胞：野生型（Wide type，WT）和AR敲除型（AR knock-out，AR KO）C57BL/6J小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMDMs）和來源于小鼠巨噬細(xì)胞瘤的RAW264.7細(xì)胞系。 2)設(shè)計AR siRNA，轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞，，并評價效果。 3)體外模擬炎癥反應(yīng)，提總蛋白，western blot檢測各組經(jīng)典NF-κB信號通路上下游的關(guān)鍵分子TLR4，IKKβ，IKKγ，IκBα，p62和iNOS，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的AR缺陷（AR knockout或者knockdown）組IKKβ和IKKγ蛋白水平較AR正常組低。 4)提總mRNA，qPCR檢測各組IKKβ和IKKγ mRNA水平，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的AR缺陷組IKKβ和IKKγ mRNA水平和對照組并沒有差異，說明LPS誘導(dǎo)的AR缺陷巨噬細(xì)胞的IKKβ和IKKγ蛋白降低發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。 5)爬片，免疫組化觀察各組LC3（自噬體Marker）和LAMP1（溶酶體Marker）標(biāo)記的巨噬細(xì)胞，了解AR缺陷對自噬體形成和成熟的影響；提總蛋白，westernblot檢測各組LC3和LAMP1蛋白水平；收集細(xì)胞，制超薄切片，透射電鏡觀察各組自噬體和自噬溶酶體。 6)爬片，免疫組化觀察各組IKKβ、IKKγ分別與LC3和LAMP1的共標(biāo)情況。 7)爬片，免疫組化觀察各組IKKβ、IKKγ分別與泛素（Ub）和p62的共標(biāo)情況。 8)用3-MA阻斷自噬，提總蛋白，western blot檢測各組LC3，IKKβ，IKKγ和iNOS的變化。 【結(jié)論】 1）AR缺陷對固有免疫反應(yīng)的抑制是由于經(jīng)典NF-κB信號通路中的IKK復(fù)合體（IKKβ和IKKγ）在轉(zhuǎn)錄后水平被降解； 2）AR缺陷可以誘發(fā)自噬體形成，LPS刺激會進一步促進自噬體形成和自噬體成熟； 3）LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的IKKβ和IKKγ廣泛地與自噬體和溶酶體結(jié)合； 4）LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的IKKβ和IKKγ廣泛地泛素化并被p62識別結(jié)合； 5）藥物阻斷自噬后，IKK復(fù)合體的蛋白水平和iNOS表達(dá)水平顯著增高。綜上所述，可以得出結(jié)論，AR缺陷通過激活自噬途徑抑制固有免疫反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2621790