【摘要】：哺乳動物細(xì)胞是表達(dá)具有天然活性蛋白的重要宿主，而中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)是用于真核基因表達(dá)的最成功的哺乳動物細(xì)胞。但在該細(xì)胞中重組蛋白的產(chǎn)量較低，這一直是影響其更廣泛應(yīng)用的一個問題。人們已在選擇合適的表達(dá)載體和有效的啟動子和增強(qiáng)子方面做了大量工作，取得很多進(jìn)展，同時開始關(guān)注外源基因與中華倉鼠卵巢細(xì)胞密碼子的匹配程度對外源基因表達(dá)的影響，因?yàn)槿藗冏⒁獾皆诖竽c桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)中，很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)在不改變外源基因氨基酸順序的條件下，盡量使用大腸桿菌和酵母的偏愛密碼子，，可明顯提高外源基因的表達(dá)水平。因此研究CHO細(xì)胞密碼子使用特點(diǎn)，將為從偏愛密碼子角度來探索不同外源基因在CHO細(xì)胞表達(dá)水平提供新思路，為外源基因在CHO細(xì)胞中的高表達(dá)奠定理論基礎(chǔ)。 中華倉鼠卵巢細(xì)胞，是高度特異化細(xì)胞，我們目前常用于表達(dá)的CHOdhfr細(xì)胞株是野型CHO傳代細(xì)胞經(jīng)多次誘變的營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。而從GenBank中獲得的來自中華倉鼠卵巢細(xì)胞中cDNA序列數(shù)量有限，因此要研究密碼子使用特點(diǎn)就需要構(gòu)建中華倉鼠卵巢細(xì)胞cDNA文庫以獲得更多數(shù)量的cDNA序列。本文選取生長旺盛的CHO dhfr細(xì)胞，提取高豐度mRNA，合成cDNA連接到pUC18中，建立適用于高豐度mRNA的質(zhì)粒cDNA文庫。根據(jù)以前的研究結(jié)果，偏愛密碼子的選擇與基因長短無關(guān)，因此隨機(jī)挑選150個克隆，每個克隆測一個反應(yīng)平均長度在550bp左右。通過BLAST程序，去除假基因，tRNA和rRNA基因，重復(fù)序列基因，非編碼區(qū)核苷酸序列，重復(fù)的cDNA序列等，最后剩下50個合格的編碼蛋白質(zhì)cDNA序列。
【圖文】：

倉鼠卵巢細(xì)胞cDN的提取和mRNA的從80%一90%成片細(xì)0ulDEPC水中，取456，A280=0.258，A23=0A260/A28。在1.7一2.0白質(zhì)和硫氰酸呱咤的凝膠電泳簽定，可見帶型清晰，285:RN鼠卵巢細(xì)胞總RNA

圖2中華倉鼠卵巢細(xì)胞cDNA文庫酶切分析MI:人一EeoT14digestMZ:DL2000DNAMarker以EcoRI酶切的中華倉鼠卵巢細(xì)胞cDNA中華倉鼠卵巢細(xì)胞cDNA文庫核昔酸序列分析頻率是某種密碼子在由許多讀碼框組成的讀碼框庫中出在讀碼框庫中出現(xiàn)的次數(shù)之比。.每個物種目前所測得的讀碼框庫的庫容量大小不同，但根據(jù)數(shù)據(jù)庫CU丁G(corfomGenBank)密碼子使用頻率的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在核普酸序密碼子使用頻率雖有一些變化，但是按照使用頻率所確卻基本相似.。1992年版CU丁G中華倉鼠密碼子使用頻個COS，，7，238個核普酸的基礎(chǔ)上[77]，而1999年版中的統(tǒng)計用了2，7個COS，109，395個核普酸口]a，但密碼很小.以eIu為例可以看出這種趨勢。
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 畢永春;利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);2001年05期

本文編號：2619295