【摘要】：哺乳動物細胞是表達具有天然活性蛋白的重要宿主，而中華倉鼠卵巢細胞(CHO)是用于真核基因表達的最成功的哺乳動物細胞。但在該細胞中重組蛋白的產量較低，這一直是影響其更廣泛應用的一個問題。人們已在選擇合適的表達載體和有效的啟動子和增強子方面做了大量工作，取得很多進展，同時開始關注外源基因與中華倉鼠卵巢細胞密碼子的匹配程度對外源基因表達的影響，因為人們注意到在大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)中，很多實驗已經證實在不改變外源基因氨基酸順序的條件下，盡量使用大腸桿菌和酵母的偏愛密碼子，，可明顯提高外源基因的表達水平。因此研究CHO細胞密碼子使用特點，將為從偏愛密碼子角度來探索不同外源基因在CHO細胞表達水平提供新思路，為外源基因在CHO細胞中的高表達奠定理論基礎。 中華倉鼠卵巢細胞，是高度特異化細胞，我們目前常用于表達的CHOdhfr細胞株是野型CHO傳代細胞經多次誘變的營養(yǎng)缺陷型細胞。而從GenBank中獲得的來自中華倉鼠卵巢細胞中cDNA序列數量有限，因此要研究密碼子使用特點就需要構建中華倉鼠卵巢細胞cDNA文庫以獲得更多數量的cDNA序列。本文選取生長旺盛的CHO dhfr細胞，提取高豐度mRNA，合成cDNA連接到pUC18中，建立適用于高豐度mRNA的質粒cDNA文庫。根據以前的研究結果，偏愛密碼子的選擇與基因長短無關，因此隨機挑選150個克隆，每個克隆測一個反應平均長度在550bp左右。通過BLAST程序，去除假基因，tRNA和rRNA基因，重復序列基因，非編碼區(qū)核苷酸序列，重復的cDNA序列等，最后剩下50個合格的編碼蛋白質cDNA序列。
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倉鼠卵巢細胞cDN的提取和mRNA的從80%一90%成片細0ulDEPC水中，取456，A280=0.258，A23=0A260/A28。在1.7一2.0白質和硫氰酸呱咤的凝膠電泳簽定，可見帶型清晰，285:RN鼠卵巢細胞總RNA

圖2中華倉鼠卵巢細胞cDNA文庫酶切分析MI:人一EeoT14digestMZ:DL2000DNAMarker以EcoRI酶切的中華倉鼠卵巢細胞cDNA中華倉鼠卵巢細胞cDNA文庫核昔酸序列分析頻率是某種密碼子在由許多讀碼框組成的讀碼框庫中出在讀碼框庫中出現的次數之比。.每個物種目前所測得的讀碼框庫的庫容量大小不同，但根據數據庫CU丁G(corfomGenBank)密碼子使用頻率的統(tǒng)計發(fā)現，在核普酸序密碼子使用頻率雖有一些變化，但是按照使用頻率所確卻基本相似.。1992年版CU丁G中華倉鼠密碼子使用頻個COS，，7，238個核普酸的基礎上[77]，而1999年版中的統(tǒng)計用了2，7個COS，109，395個核普酸口]a，但密碼很小.以eIu為例可以看出這種趨勢。
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R-332

【參考文獻】

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1 畢永春;利用哺乳動物細胞表達外源蛋白的研究進展[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);2001年05期

本文編號：2619295