【摘要】：肝臟是體內(nèi)物質(zhì)代謝的一個(gè)重要器官。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在生理狀態(tài)下肝細(xì)胞的更新和肝切除后肝臟的恢復(fù)主要是通過(guò)成熟肝細(xì)胞的有絲分裂來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，在受到物理或化學(xué)因素的嚴(yán)重?fù)p傷后，肝臟結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)則主要是通過(guò)肝干細(xì)胞的增殖與分化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。一般意義上的肝干細(xì)胞是指具有旺盛的增殖能力，并可以分化為成熟肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的肝臟原始細(xì)胞。已有的證據(jù)表明，肝干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其深入研究對(duì)于肝臟發(fā)育、肝臟腫瘤和肝臟再生的發(fā)生機(jī)理以及其臨床防治都具有重要的價(jià)值。目前對(duì)于肝干細(xì)胞的研究還處于分離、培養(yǎng)和建系的初級(jí)階段，而且又主要集中于對(duì)嚙齒類動(dòng)物的研究。至于人肝干細(xì)胞的研究，有人報(bào)道過(guò)人胎肝來(lái)源的原始上皮細(xì)胞系(Malhj H，2002)，但其細(xì)胞系實(shí)際上是一個(gè)沒(méi)有純化(即未經(jīng)篩選和克隆化培養(yǎng))的混合培養(yǎng)物，而且在體外不能穩(wěn)定生長(zhǎng)(即伴有明顯的自發(fā)分化現(xiàn)象)。本文在所在實(shí)驗(yàn)室成功分離培養(yǎng)了小鼠肝干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，擬從人胎肝中分離并建立可以在體外穩(wěn)定長(zhǎng)期培養(yǎng)的肝干細(xì)胞系，為肝臟腫瘤和肝臟再生等相關(guān)生物醫(yī)學(xué)問(wèn)題的認(rèn)識(shí)提供一個(gè)全新的切入點(diǎn)，進(jìn)而為各種因素所致的，包括肝功能衰竭在內(nèi)的，肝臟代謝性疾病的細(xì)胞治療研究提供細(xì)胞來(lái)源和相關(guān)的知識(shí)。 本研究以4.5～6周的流產(chǎn)人胚胎作為分離肝干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)材料(因?yàn)橐呀?jīng)知道，胎肝在胚胎發(fā)育的第4周開始發(fā)生，而且已經(jīng)知道，此時(shí)的胎肝中的干細(xì)胞的含量相對(duì)較高)。經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件的不斷優(yōu)化和克隆化培養(yǎng)，最終建立了11個(gè)可以在體外長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，并將其命名為hFLSC(Human FetalLiver-derived Stem Cells)。這些細(xì)胞系具有相似的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力和分子表型。在此基礎(chǔ)上，本丈對(duì)其中的一個(gè)細(xì)胞系(編號(hào)FLO31204-2)的基本生物學(xué)特性進(jìn)行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系具有如下特征： (1) hFLSC細(xì)胞形態(tài)為均一的小三角形。hFLSC細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核較大，圓形，有1～3個(gè)核仁。細(xì)胞之間有較長(zhǎng)的突起相連。在傳代過(guò)程中該細(xì)胞的形態(tài)基本保持不變。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞核質(zhì)比極大，且細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器極少。 (2) hFLSC細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力。目前該細(xì)胞系已在體外培養(yǎng)達(dá)7個(gè) 月之久，傳代25代以上，而且其增殖能力相對(duì)穩(wěn)定.核型分析顯示染色體數(shù)目 正常，荷瘤實(shí)驗(yàn)表明該細(xì)胞系無(wú)致瘤性. (3) hFLSC細(xì)胞表達(dá)多種類型的分子標(biāo)志.R不尸CR、免疫細(xì)胞化學(xué)和流 式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，該細(xì)胞系不僅表達(dá)肝干細(xì)胞相關(guān)的分子標(biāo)志(如AF尸、 ALB、CKS、CK18、CK19、GGT、DPPIV、e一Met、Thy一1和e一kit等)，而且還 表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的部分分子標(biāo)志(如CO44、COZg、SOF一1等)，但不表達(dá)造血細(xì) 胞的標(biāo)志(如CO34和CO45)。其中流式分析顯示CO44、CO29的表達(dá)率高達(dá) 99%以上，而免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示AFP、ALB、CKS、CK18、GGT、DPPfV、 c一Met和c一kit等標(biāo)志也幾乎在全部細(xì)胞都有所表達(dá)，由此推測(cè)hFLSC可以共表達(dá) 間質(zhì)細(xì)胞和肝干細(xì)胞的相關(guān)分子標(biāo)志。另外，R丁一尸CR檢測(cè)顯示hFLSC有多能性 干細(xì)胞標(biāo)志Oct4的表達(dá)，提示h廠LSC是胎肝來(lái)源的一種原始的干細(xì)胞。 (引體外誘導(dǎo)分化研究顯示h FLSC細(xì)胞具有多潛能性.有研究表明丁酸鈉 可以誘導(dǎo)小鼠肝索細(xì)胞(hePatoblasts)向肝細(xì)胞方向分化(Rogler LE，1997)。 在丁酸鈉作用下，hFLSC的生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞變得扁平而寬大，核質(zhì)比 明顯縮小，并有約10~15%雙核細(xì)胞的出現(xiàn)。電鏡下可見(jiàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi) 具有豐富的細(xì)胞器，以及大量的糖原顆粒，并可見(jiàn)到細(xì)胞間膽管樣結(jié)構(gòu).RT-尸CR 結(jié)果顯示白蛋白(albumin，ALB)在誘導(dǎo)后表達(dá)增強(qiáng)。酸性Sehiff’s(Periodie acid一Schiff，PAS)實(shí)驗(yàn)顯示在誘導(dǎo)后的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量糖原顆粒。這些結(jié) 果提示，hFLSC在丁酸鈉誘導(dǎo)下分化形成肝細(xì)胞。另外，膽管細(xì)胞標(biāo)志CKlg、 OPPIV和GGT的表達(dá)也有所增強(qiáng)，提示hFLSC可以向膽管細(xì)胞方向分化.但可 能由于這是一個(gè)平面的誘導(dǎo)分化體系，未見(jiàn)到明顯的膽管樣結(jié)構(gòu)。因此我們正在 嘗試用Matrigel丫M基質(zhì)膠誘導(dǎo)hFLSC向膽管細(xì)胞方向分化，目前尚未得到結(jié)果。 其次，利用骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)hFLSC進(jìn)行了誘 導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞形態(tài)變大，呈長(zhǎng)而寬的梭形，，兩天后鏡下可見(jiàn)約10%的細(xì) 胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)折光率很高、大小不等的黃色脂滴樣顆粒。十天后60%以上的細(xì) 胞中可以見(jiàn)到脂滴樣顆粒。第13天時(shí)，對(duì)其細(xì)胞用脂類特異性結(jié)合染料油紅一0 染色，在約90%的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不等的紅染脂滴.同時(shí)，用RT一PCR方法 在這種細(xì)胞的mRNA中檢測(cè)到了脂肪特異性標(biāo)志物一過(guò)氧化物酶體增殖物激 活受體2(Peroxisome Proliferators一etivated ReeePtorZ，PPAR vZ)一的表 達(dá)，這說(shuō)明了hFLSC具有向脂肪細(xì)胞分化的潛能.另外，在成骨誘導(dǎo)體系作用 下，大多數(shù)hFLSC細(xì)胞變成扁平的立方形或多角形細(xì)胞，并可見(jiàn)折光率很高的 鈣化點(diǎn)出現(xiàn).堿性磷酸酶染色可見(jiàn)有大約30%的細(xì)胞呈陽(yáng)性，而且有!型膠原的 表達(dá).這些都提示h FLSC可以向成骨細(xì)胞方向分化.除此之外，本文也探討了 口一疏基乙醇(p一mercaptoethanol，BME)和全反式維甲酸(All一rans Retinoie ACid，ATRA)對(duì)h
【圖文】：

hFLSC細(xì)胞體積較小，直徑約8~10pm。細(xì)胞核較大，圓形，有1一3個(gè)核仁。形態(tài)呈小三角形，細(xì)胞之間有較長(zhǎng)的突起相連。不同于典型的上皮樣細(xì)胞的鋪路石樣外觀，也非成纖維細(xì)胞的長(zhǎng)梭形外觀(圖3)。電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核質(zhì)比極大，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器極少(圖4)。圖3:hFLSC在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)(100x)圖4:hFLSC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

形態(tài)呈小三角形，細(xì)胞之間有較長(zhǎng)的突起相連。不同于典型的上皮樣細(xì)胞的鋪路石樣外觀，也非成纖維細(xì)胞的長(zhǎng)梭形外觀(圖3)。電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核質(zhì)比極大，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器極少(圖4)。圖3:hFLSC在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)(100x)圖4:hFLSC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R329.2

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2613659