發(fā)布時間：2020-04-03 20:22

【摘要】：肝臟是體內(nèi)物質(zhì)代謝的一個重要器官。動物實驗結(jié)果表明，在生理狀態(tài)下肝細胞的更新和肝切除后肝臟的恢復主要是通過成熟肝細胞的有絲分裂來實現(xiàn)的。然而，在受到物理或化學因素的嚴重損傷后，肝臟結(jié)構(gòu)和功能的恢復則主要是通過肝干細胞的增殖與分化來實現(xiàn)的。一般意義上的肝干細胞是指具有旺盛的增殖能力，并可以分化為成熟肝細胞和膽管上皮細胞的肝臟原始細胞。已有的證據(jù)表明，肝干細胞的分離培養(yǎng)及其深入研究對于肝臟發(fā)育、肝臟腫瘤和肝臟再生的發(fā)生機理以及其臨床防治都具有重要的價值。目前對于肝干細胞的研究還處于分離、培養(yǎng)和建系的初級階段，而且又主要集中于對嚙齒類動物的研究。至于人肝干細胞的研究，有人報道過人胎肝來源的原始上皮細胞系(Malhj H，2002)，但其細胞系實際上是一個沒有純化(即未經(jīng)篩選和克隆化培養(yǎng))的混合培養(yǎng)物，而且在體外不能穩(wěn)定生長(即伴有明顯的自發(fā)分化現(xiàn)象)。本文在所在實驗室成功分離培養(yǎng)了小鼠肝干細胞的基礎(chǔ)上，擬從人胎肝中分離并建立可以在體外穩(wěn)定長期培養(yǎng)的肝干細胞系，為肝臟腫瘤和肝臟再生等相關(guān)生物醫(yī)學問題的認識提供一個全新的切入點，進而為各種因素所致的，包括肝功能衰竭在內(nèi)的，肝臟代謝性疾病的細胞治療研究提供細胞來源和相關(guān)的知識。 本研究以4.5～6周的流產(chǎn)人胚胎作為分離肝干細胞的實驗材料(因為已經(jīng)知道，胎肝在胚胎發(fā)育的第4周開始發(fā)生，而且已經(jīng)知道，此時的胎肝中的干細胞的含量相對較高)。經(jīng)過對培養(yǎng)條件的不斷優(yōu)化和克隆化培養(yǎng)，最終建立了11個可以在體外長期穩(wěn)定傳代的細胞系，并將其命名為hFLSC(Human FetalLiver-derived Stem Cells)。這些細胞系具有相似的細胞形態(tài)、增殖能力和分子表型。在此基礎(chǔ)上，本丈對其中的一個細胞系(編號FLO31204-2)的基本生物學特性進行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)該細胞系具有如下特征： (1) hFLSC細胞形態(tài)為均一的小三角形。hFLSC細胞體積較小，細胞核較大，圓形，有1～3個核仁。細胞之間有較長的突起相連。在傳代過程中該細胞的形態(tài)基本保持不變。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)該細胞核質(zhì)比極大，且細胞質(zhì)中細胞器極少。 (2) hFLSC細胞具有強大的增殖能力。目前該細胞系已在體外培養(yǎng)達7個 月之久，傳代25代以上，而且其增殖能力相對穩(wěn)定.核型分析顯示染色體數(shù)目 正常，荷瘤實驗表明該細胞系無致瘤性. (3) hFLSC細胞表達多種類型的分子標志.R不尸CR、免疫細胞化學和流 式細胞分析結(jié)果顯示，該細胞系不僅表達肝干細胞相關(guān)的分子標志(如AF尸、 ALB、CKS、CK18、CK19、GGT、DPPIV、e一Met、Thy一1和e一kit等)，而且還 表達間質(zhì)細胞的部分分子標志(如CO44、COZg、SOF一1等)，但不表達造血細 胞的標志(如CO34和CO45)。其中流式分析顯示CO44、CO29的表達率高達 99%以上，而免疫細胞化學分析顯示AFP、ALB、CKS、CK18、GGT、DPPfV、 c一Met和c一kit等標志也幾乎在全部細胞都有所表達，由此推測hFLSC可以共表達 間質(zhì)細胞和肝干細胞的相關(guān)分子標志。另外，R丁一尸CR檢測顯示hFLSC有多能性 干細胞標志Oct4的表達，提示h廠LSC是胎肝來源的一種原始的干細胞。 (引體外誘導分化研究顯示h FLSC細胞具有多潛能性.有研究表明丁酸鈉 可以誘導小鼠肝索細胞(hePatoblasts)向肝細胞方向分化(Rogler LE，1997)。 在丁酸鈉作用下，hFLSC的生長受到明顯抑制，細胞變得扁平而寬大，核質(zhì)比 明顯縮小，并有約10~15%雙核細胞的出現(xiàn)。電鏡下可見誘導后細胞的胞質(zhì)內(nèi) 具有豐富的細胞器，以及大量的糖原顆粒，并可見到細胞間膽管樣結(jié)構(gòu).RT-尸CR 結(jié)果顯示白蛋白(albumin，ALB)在誘導后表達增強。酸性Sehiff’s(Periodie acid一Schiff，PAS)實驗顯示在誘導后的細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量糖原顆粒。這些結(jié) 果提示，hFLSC在丁酸鈉誘導下分化形成肝細胞。另外，膽管細胞標志CKlg、 OPPIV和GGT的表達也有所增強，提示hFLSC可以向膽管細胞方向分化.但可 能由于這是一個平面的誘導分化體系，未見到明顯的膽管樣結(jié)構(gòu)。因此我們正在 嘗試用Matrigel丫M基質(zhì)膠誘導hFLSC向膽管細胞方向分化，目前尚未得到結(jié)果。 其次，利用骨髓間充質(zhì)細胞向脂肪細胞誘導分化的實驗條件對hFLSC進行了誘 導分化，發(fā)現(xiàn)其細胞形態(tài)變大，呈長而寬的梭形，，兩天后鏡下可見約10%的細 胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)折光率很高、大小不等的黃色脂滴樣顆粒。十天后60%以上的細 胞中可以見到脂滴樣顆粒。第13天時，對其細胞用脂類特異性結(jié)合染料油紅一0 染色，在約90%的細胞胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的紅染脂滴.同時，用RT一PCR方法 在這種細胞的mRNA中檢測到了脂肪特異性標志物一過氧化物酶體增殖物激 活受體2(Peroxisome Proliferators一etivated ReeePtorZ，PPAR vZ)一的表 達，這說明了hFLSC具有向脂肪細胞分化的潛能.另外，在成骨誘導體系作用 下，大多數(shù)hFLSC細胞變成扁平的立方形或多角形細胞，并可見折光率很高的 鈣化點出現(xiàn).堿性磷酸酶染色可見有大約30%的細胞呈陽性，而且有!型膠原的 表達.這些都提示h FLSC可以向成骨細胞方向分化.除此之外，本文也探討了 口一疏基乙醇(p一mercaptoethanol，BME)和全反式維甲酸(All一rans Retinoie ACid，ATRA)對h
【圖文】：

hFLSC細胞體積較小，直徑約8~10pm。細胞核較大，圓形，有1一3個核仁。形態(tài)呈小三角形，細胞之間有較長的突起相連。不同于典型的上皮樣細胞的鋪路石樣外觀，也非成纖維細胞的長梭形外觀(圖3)。電鏡下可見細胞核質(zhì)比極大，胞質(zhì)內(nèi)細胞器極少(圖4)。圖3:hFLSC在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)(100x)圖4:hFLSC細胞的超微結(jié)構(gòu)

形態(tài)呈小三角形，細胞之間有較長的突起相連。不同于典型的上皮樣細胞的鋪路石樣外觀，也非成纖維細胞的長梭形外觀(圖3)。電鏡下可見細胞核質(zhì)比極大，胞質(zhì)內(nèi)細胞器極少(圖4)。圖3:hFLSC在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)(100x)圖4:hFLSC細胞的超微結(jié)構(gòu)
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R329.2

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 魏春山;唐海鴻;童光東;陳孝銀;;不同來源肝干細胞的定向分化潛能[J];中國組織工程研究;2012年45期

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 劉芳遐;人肝源性干細胞在Fah~(-/-)Rag2~(-/-)小鼠中生物學行為的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2010年

本文編號：2613659