【摘要】：目的克隆斑馬魚nrg1基因，檢測(cè)nrg1在成年斑馬魚腸道及胚胎中的表達(dá)模式，了解nrg1是否與腸道發(fā)育相關(guān)。 方法從斑馬魚腸道和不同時(shí)期胚胎中提取總RNA，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出nrg1基因，對(duì)不同物種nrg1進(jìn)行同源性分析，并作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；再將nrg1克隆至pGEM-T easy載體，體外合成地高辛標(biāo)記的RNA探針，原位雜交技術(shù)檢測(cè)nrg1在成年斑馬魚腸道中及胚胎中的表達(dá)。 結(jié)果克隆出斑馬魚nrg1基因，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證克隆正確，斑馬魚nrg1與人類的nrg1同源性較高，為67%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析得知nrg1在斑馬魚中的進(jìn)化速度最快，然后依次為小鼠、雞、人及大鼠，其中斑馬魚nrg1與小鼠的親緣關(guān)系較近。Nrg1表達(dá)于成年斑馬魚腸道的粘膜層腸細(xì)胞中，杯狀細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)，在肌層和漿膜層均未見(jiàn)表達(dá)；在胚胎中，nrg1從囊胚期即開(kāi)始表達(dá)，隨后在原腸胚期及體節(jié)期均有較強(qiáng)表達(dá),主要位于動(dòng)物極；在咽囊期nrg1RNA表達(dá)較弱；孵化期開(kāi)始nrg1水平升高，且在斑馬魚腸道位置可以檢測(cè)到nrg1的表達(dá)，至120hpf（hours post-fertilization，受精后數(shù)小時(shí)）表達(dá)減弱。 結(jié)論斑馬魚nrg1與人類、小鼠、大鼠nrg1有較高的同源性，其中與小鼠的親緣性較近。斑馬魚nrg1表達(dá)于成年斑馬魚腸道，在胚胎中自囊胚即開(kāi)始表達(dá)，并表達(dá)于幼體的腸道中，提示nrg1可能與腸道的發(fā)育有關(guān)。 目的建立斑馬魚nrg1敲低及過(guò)表達(dá)模型，分析nrg1表達(dá)水平變化后的胚胎表型變化。 方法向斑馬魚胚胎共同注射嗎啉代反義寡核苷酸（morpholino, MO）及EGFP-nrg1線性化載體，通過(guò)觀察熒光強(qiáng)弱判斷敲低效率；分別/共同注射nrg1MO及nrg1RNA，觀察改變nrg1表達(dá)水平導(dǎo)致的胚胎表型變化。 結(jié)果共同注射nrg1-EGFP線性化載體及control-MO后，12hpf開(kāi)始胚胎內(nèi)即有有較強(qiáng)的熒光表達(dá)；共同注射nrg1-EGFP線性化載體及nrg1-MO后不能正常表達(dá)融合蛋白，綠色熒光明顯減弱，說(shuō)明nrg1可被nrg1-MO有效的敲低。與對(duì)照組相比，注射nrg1-MO后，可觀察到斑馬魚胚胎死亡率較對(duì)照組高，孵出延遲，頭部畸形，身體變短，軀體扭曲等改變，游動(dòng)速度緩慢；注射nrg1RNA表型沒(méi)有明顯變化；注射nrg1-MO及nrg1RNA后，可部分補(bǔ)救MO所致表型變化。 結(jié)論ATG-MO能有效地敲低nrg1蛋白表達(dá)水平；干擾nrg1的表達(dá)能導(dǎo)致斑馬魚胚胎畸形，生長(zhǎng)發(fā)育延遲甚至死亡。 目的研究nrg1對(duì)腸神經(jīng)增殖、分化及遷移的影響。 方法將斑馬魚胚胎分為四組并做不同處理：對(duì)照組、nrg1敲低組、nrg1過(guò)表達(dá)組及nrg1回補(bǔ)組，收集各組不同發(fā)育階段的胚胎（66，72，88，96，120及144hpf），將胚胎固定于4%多聚甲醛（含1‰DEPC）中，蛋白酶K消化，洗滌，封閉，加入一抗：anti-phosphohistone H3（腸神經(jīng)增殖）及anti-Hu mAb16A11抗體（腸神經(jīng)分化及遷移），4℃孵育過(guò)夜，洗滌并加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗，洗脫二抗，熒光共聚焦顯微鏡下拍照。 結(jié)果敲低nrg1可使腸神經(jīng)增殖減少；敲低nrg1后，分化的腸神經(jīng)較對(duì)照組減少；過(guò)表達(dá)nrg1，分化的腸神經(jīng)數(shù)目在四種干預(yù)中最多；回補(bǔ)nrg1，分化的腸神經(jīng)數(shù)目較敲低組多，但較對(duì)照組及過(guò)表達(dá)組少。對(duì)照組中，腸神經(jīng)元在66hpf主要位于腸道近端，在72hpf、96hpf腸神經(jīng)由腸道近端向中段及尾端遷移，至120hpf遷移至尾端，數(shù)目較多。注射nrg1-MO后，在66hpf腸道近端存在腸神經(jīng)元，而在72hpf、96hpf，腸神經(jīng)由腸道近端向中段及尾端遷移過(guò)程停滯，至120hpf遷移至尾端腸神經(jīng)數(shù)目較少。 結(jié)論Nrg1可影響腸神經(jīng)增殖、分化過(guò)程，nrg1敲低后，腸神經(jīng)前體細(xì)胞遷移至腸道近端之前的過(guò)程不受影響，而腸神經(jīng)由腸道近端遷移至尾端這一過(guò)程停滯。 目的研究nrg1對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。 方法將斑馬魚胚胎分為四組并做不同處理：對(duì)照組、nrg1敲低組、nrg1過(guò)表達(dá)組及nrg1回補(bǔ)組，收集各組不同發(fā)育階段的胚胎（36,48及60hpf），將胚胎固定于4%多聚甲醛（含1‰DEPC）中，4℃固定過(guò)夜，蛋白酶K適度消化，雜交液65℃預(yù)雜交3h后,加入相應(yīng)雜交探針65℃雜交過(guò)夜，封閉液封閉1h,加入地高辛標(biāo)記的一抗4℃孵育過(guò)夜。PBST洗脫抗體3次，，每次30min, NBT/BCIP染色，顯色后PBST洗滌，拍照或置于30%甘油/PBS中保存。 結(jié)果敲低nrg1后，腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因ret、gdnf、phox2b、sox10、shh表達(dá)明顯減少；過(guò)表達(dá)nrg1，以上基因水平均無(wú)明顯變化；nrg1RNA可以拯救反義寡核苷酸引起的表型變化，以上基因表達(dá)水較敲低模型增多。敲低nrg1組與對(duì)照組相比，crestin在36hpf表達(dá)無(wú)明顯變化,但在60hpf中表達(dá)較對(duì)照組減弱。 結(jié)論Nrg1表達(dá)異�？墒鼓c神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因ret、gdnf、phox2b、sox10、shh的表達(dá)改變，證明nrg1與腸神經(jīng)發(fā)育緊密相關(guān)。敲低nrg1后crestin在腸神經(jīng)遷移至腸道時(shí)仍有表達(dá)，但在腸道遷移過(guò)程中表達(dá)減少，提示nrg1主要在腸神經(jīng)前體細(xì)胞達(dá)到腸道后才開(kāi)始發(fā)揮作用。 目的研究nrg1對(duì)腸道迷走神經(jīng)纖維發(fā)育及分布的影響。 方法將斑馬魚胚胎分為對(duì)照組及nrg1敲低組并做不同處理，收集96hpf與7dpf胚胎，固定于4%多聚甲醛（含1‰DEPC）中，蛋白酶K消化，洗滌，封閉，加入一抗Acetylated α-tubulin,4℃孵育過(guò)夜，洗滌并加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗，洗脫二抗，熒光共聚焦顯微鏡下拍照。 結(jié)果在96hpf，敲低nrg1后斑馬魚腸道迷走神經(jīng)纖維粗大，紊亂，變短；在7dpf,可見(jiàn)對(duì)照組斑馬魚腸道內(nèi)迷走神經(jīng)纖維分布至腸道內(nèi)，并呈網(wǎng)狀排列，而敲低nrg1后未見(jiàn)神經(jīng)纖維伸入腸道。 結(jié)論Nrg1不僅參與腸神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，也影響迷走神經(jīng)纖維由腸道近端向遠(yuǎn)端延伸并分布至腸道壁內(nèi)這一系列的過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R321

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2613603