【摘要】：結(jié)核病Mycobacterium tuberculosis,尤其是耐藥結(jié)核病,仍然嚴(yán)重威脅著人類健康。2012年全耐藥結(jié)核病(totally drug-resistant tuberculosis, TDR-TB)病例在印度的報(bào)道,更凸顯結(jié)核病耐藥機(jī)制研究的緊迫性。敏感性結(jié)核病轉(zhuǎn)化為耐藥結(jié)核后,藥物選擇更少,療效更差,治療時(shí)間至少延長4倍,治療費(fèi)用數(shù)倍增加,細(xì)致研究耐藥機(jī)理與新型免疫治療手段是有望解決這一問題的兩種途徑。我們想從泛耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的蛋白質(zhì)組學(xué)中尋找線索。利用iTRAQ (Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation,用于相對和絕對定量的等量異位標(biāo)簽技術(shù))技術(shù),我們在兩株XDR-TB與敏感菌株的差異蛋白表達(dá)譜中尋找到了高表達(dá)蛋白wag31。該蛋白已被證明與菌體形態(tài),肽聚糖合成密切相關(guān)。利用模式菌株恥垢分枝桿菌M. smegma tis,我們構(gòu)建了wag31高表達(dá)菌株,wag31低表達(dá)菌株,驗(yàn)證了過往研究中的結(jié)論,wag31過表達(dá)會(huì)造成膨大細(xì)胞,細(xì)胞裂解,發(fā)現(xiàn)了wag31低表達(dá)會(huì)造成的菌體延長與細(xì)胞分裂不均等程度的降低。隨后,我們對wag31低表達(dá)菌株與對照菌株檢測藥物敏感性發(fā)現(xiàn),wag31低表達(dá)菌株對利福平,紅霉素的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)下降為對照組的1/4,對氯法齊明,新生霉素的MIC下降將為對照組的1/2,菌體脂類通透性實(shí)驗(yàn)也證明,wag31低表達(dá)提高了菌體的脂類通透性。提示我們多種脂溶性藥物的敏感性提高可能與菌體脂類通透性改變有關(guān)。我們知道分枝菌酸作為分枝桿菌細(xì)胞壁的主要成分,提供了主要脂類屏蔽作用。借由以上,我們進(jìn)行了wag31的coIP實(shí)驗(yàn),找到了一系列候選結(jié)合蛋白,其中有多個(gè)蛋白都參與分枝菌酸的合成通路,Rv3285 (AccA3), Rv3799c (AccD4), Rv3280 (AccD5), Rv2524c (fas), Rv1484 (inhA),還有若干ATP酶。隨后,我們選擇了已知參與分枝桿菌長鏈脂肪酸合成過程的Rv3285作為研究對象,構(gòu)建過表達(dá)M. smegmatis菌株,發(fā)現(xiàn)該蛋白的過表達(dá)降低了菌體的脂類通透性,提高了對利福平新生霉素的耐藥性,MIC均提高了兩倍。我們認(rèn)為,wag31通過調(diào)節(jié)菌體脂類通透性維持菌體耐藥性,而且Rv3285參與到這種調(diào)控作用中。在免疫治療方面,我們研究了wag31與Ag85a+wag31融合基因構(gòu)建的DNA疫苗在小鼠模型上的保護(hù)效果。含有wag31的DNA疫苗免疫小鼠后,小鼠外周血中表現(xiàn)出較高的CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比例。分離小鼠的脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)再刺激,wag31與Ag85a均可以引起高水平的IFN-gamma分泌水平(Ag85a最高),同時(shí)IL-4分泌水平很低,維持在最低檢出值左右,這說明了DNA疫苗聯(lián)用wag31與Ag85a可以刺激T淋巴細(xì)胞成熟并提高IFN-gamma分泌水平,激活Th1型免疫反應(yīng),是一種有效的抗原組合,有潛力成為新的候選保護(hù)性疫苗與DNA治療性疫苗。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

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1 徐文璽;Wag31介導(dǎo)的分枝桿菌藥物耐受機(jī)制與Wag31 DNA疫苗免疫效果分析[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

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本文編號：2615573