【摘要】：卒中后抑郁(post-stroke depression, PSD)是腦卒中后最常見(jiàn)的心理行為障礙并發(fā)癥,在卒中患者中的發(fā)病率約為25%-79%。PSD具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,給治療帶來(lái)極大的困難。最新研究表明,miRNA可能在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色,可以作為抑郁癥臨床治療的潛在靶點(diǎn)。作為抑郁癥中的特殊一種,PSD的發(fā)病是否也與miRNA相關(guān)呢?腦卒中患者外周血檢測(cè)發(fā)現(xiàn),有多種miRNA在急性期出現(xiàn)上調(diào)或下降,隨后在鼠類(lèi)缺血模型中的研究證實(shí)了腦內(nèi)也出現(xiàn)了相應(yīng)的miRNA變化。令人感興趣的是,在腦缺血后下調(diào)的miRNA和抑郁癥患者下調(diào)的miRNA有著部分的重疊,但這些重疊的miRNA在PSD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用尚無(wú)人研究。因此,本實(shí)驗(yàn)選取miR-137為對(duì)象,研究其對(duì)PSD大鼠模型行為學(xué)的影響,旨在為PSD發(fā)病機(jī)制和治療藥物的研究提供新的思路。 第一部分大腦中動(dòng)脈阻塞法結(jié)合慢性溫和刺激建立卒中后抑郁大鼠模型 目的：建立卒中后抑郁大鼠模型,為疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：篩選體重180～210g的清潔級(jí)健康SD大鼠,雌雄各半,正常飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境,監(jiān)測(cè)并記錄大鼠體重、蔗糖水消耗量、水平活動(dòng)得分及垂直運(yùn)動(dòng)得分。平均分為3組：對(duì)照組、卒中組與PSD(缺血加應(yīng)激)組,采用大腦中動(dòng)脈阻塞法(middle cerebral artery occlusion, MCAO)制作腦缺血再灌注模型,模型成功后選取Longa評(píng)分≥1并4的大鼠,通過(guò)慢性溫和刺激(chronic mild stress, CMS)建立PSD模型。分別采用糖水消耗試驗(yàn)、曠野試驗(yàn)(open-field test, OFT)評(píng)估大鼠快感缺失、活動(dòng)減少、行為絕望等行為。 結(jié)果：與對(duì)照組相比,PSD組大鼠體重的增長(zhǎng)明顯滯緩,于7d時(shí)PSD組大鼠體重開(kāi)始低于對(duì)照組(P0.05),于14d時(shí)體重低于卒中組(P0.05)。隨著時(shí)間變化,PSD組大鼠蔗糖水消耗比例逐漸下降。與對(duì)照組相比,14d和21d時(shí)PSD組大鼠蔗糖水消耗量明顯降低(P0.05),并且在21d時(shí)PSD組大鼠蔗糖水消耗比例低于卒中組(P0.05)。隨時(shí)間變化,PSD組大鼠水平得分逐漸下降,至21d時(shí)仍呈下降趨勢(shì),各時(shí)間段水平得分均小于對(duì)照組(P0.05)。21d時(shí),PSD組大鼠腦組織中NE、DA和5-HT含量均明顯低于對(duì)照組(P0.05)。 結(jié)論：PSD模型大鼠較充分而持續(xù)表現(xiàn)快感缺乏、活動(dòng)減少等“抑郁”核心癥狀,可操作性和重復(fù)性較好,是研究PSD較為理想的大鼠模型。 第二部分miR-137在PSD大鼠腦內(nèi)的表達(dá)及其治療作用 目的：觀察microRNA在PSD大鼠腦內(nèi)的表達(dá)及其對(duì)PSD大鼠的治療作用。 方法：①取正常大鼠、MCAO大鼠和PSD大鼠處死取腦,microarray檢測(cè)差異microRNA表達(dá),并對(duì)表達(dá)差異的microRNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證；②并選取24只SD大鼠入組：6只大鼠不作任何處理(control組)、6只大鼠經(jīng)MCAO+CMS制作PSD模型(PSD組)、6只大鼠經(jīng)MCAO+腦室注射agomir-137+CMS (agomir-137組)、6只大鼠經(jīng)MCAO+腦室注射agomir-NC+CMS (agomir-NC組),對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果：①microarray檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,PSD大鼠腦內(nèi)多種microRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào),如miR-137, miR-124, miR-181和miR-145等。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與microarray結(jié)果相符。PSD大鼠腦內(nèi)和外周血中miR-137表達(dá)水平均明顯低于正常大鼠(p0.05)。②曠野實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在腦缺血第3w,經(jīng)腦室注射agomir-137的PSD大鼠垂直得分以及水平得分均顯著高于agomir-NC組大鼠以及普通PSD大鼠(p0.05)。糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在腦缺血后第2w末起,agomir-137組大鼠糖水消耗百分比即顯著高于agomir-NC組大鼠以及普通PSD大鼠(p0.05)。 結(jié)論：①多種microRNA可能參與PSD的病理生理過(guò)程,其中以miR-137作用比較明顯；②人為增強(qiáng)內(nèi)源性miR-137表達(dá)可以發(fā)揮抗PSD的作用。 第三部分miR-137通過(guò)抑制Grin2A表達(dá)發(fā)揮對(duì)卒中后抑郁大鼠模型的治療作用 目的：尋找miR-137治療PSD的作用靶點(diǎn)。 方法：①為揭示miR-137對(duì)卒中后抑郁大鼠模型的治療作用機(jī)制,我們通過(guò)pictar、 microbase和targetscan三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)尋找miR-137的作用靶點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Grin2A基因的3'UTR端包含一個(gè)7mer大小的序列與miR-137相匹配；②為驗(yàn)證miR-137影響Grin2A的蛋白表達(dá),我們將agomir-137及其陰性對(duì)照agomir-NC、antagomir-137及其陰性對(duì)照antagomir-NC轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中,western blot檢測(cè)Grin2A水平差異。③為確定Grin2A基因的3'UTR端包含的7mer大小的序列與miR-137結(jié)合后可下調(diào)Grin2AmRNA的翻譯,我們將含此位點(diǎn)的Grin2AmRNA3'UTR構(gòu)建入luciferase報(bào)告系統(tǒng)(Grin2A-3'UTR-wt),同時(shí)將突變后的Grin2AmRNA3'UTR也插入luciferase報(bào)告系統(tǒng)中(Grin2A-3'UTR-mut)。然后將miR-137與luciferase空質(zhì)粒(empty vector)或Grin2A-3'UTR-wt質(zhì)�；騁rin2A-3'UTR-mut質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中,檢測(cè)各組細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。④為檢測(cè)Grin2A是否參與miR-137抗PSD作用,12只大鼠被添加入組：6只大鼠經(jīng)MCAO+腦室注射AAV9-CMV-Grin2A質(zhì)粒和agomir-137+CMS (agomir-137+Grin2A),6只大鼠經(jīng)MCAO+腦室注射空質(zhì)粒和agomir-137+CMS (agomir-137+vector),并對(duì)所有組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果：(DmiR-137mimic可顯著降低PC12細(xì)胞中Grin2A水平(p0.05),而miR-137inhibitor可顯著升高PC12細(xì)胞中Grin2A水平(p0.05)。②Grin2A-3'UTR-wt組熒光強(qiáng)度明顯低于其陰性對(duì)照組(miR-con),而Grin2A-3'UTR-mut組或空質(zhì)粒組熒光強(qiáng)度與其陰性對(duì)照無(wú)明顯差異。③Grin2A過(guò)表達(dá)組(agomir-137+Grin2A)的大鼠垂直得分以及水平得分均明顯低于其陰性對(duì)照(agomir-137+vector)和agomir-137組(p0.05)。并且Grin2A過(guò)表達(dá)組蔗糖水消耗百分比明顯低于其陰性對(duì)照和agomir-137組(p0.05)。 結(jié)論：miR-137可以通過(guò)與Grin2A mRNA3'UTR端結(jié)合而調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)水平,過(guò)表達(dá)Grin2A可阻斷miR-137對(duì)PSD大鼠行為學(xué)的影響,證明其參與了miR-137對(duì)PSD大鼠的治療作用。 全文結(jié)論： 1.PSD模型大鼠較充分而持續(xù)表現(xiàn)快感缺乏、活動(dòng)減少等“抑郁”核心癥狀,可操作性和重復(fù)性較好,是研究PSD較為理想的大鼠模型。 2.卒中后抑郁大鼠模型腦內(nèi)和外周血中的miR-137水平明顯下降,上調(diào)腦內(nèi)miR-137水平后可顯著改善PSD模型的行為學(xué)變化。 3.miR-137可以與Grin2A的3'UTR端結(jié)合,抑制Grin2A mRNA的翻譯從而下調(diào)其蛋白的表達(dá),而在卒中后抑郁大鼠模型的腦內(nèi)過(guò)表達(dá)Grin2A基因后,miR-137抗卒中后抑郁的作用被顯著減弱,表明阻斷Grin2A基因表達(dá)是miR-137治療PSD的作用途徑之一。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R-332;R743.3

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本文編號(hào)：2613371