【摘要】： 目的體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC),觀察體外培養(yǎng)的MSC的生物學(xué)特性。探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為構(gòu)建組織工程化角膜種子細(xì)胞的可行性及其重建角膜上皮的可能性。 方法(1)采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離,純化。將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增,傳代,進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng),探索其合適的培養(yǎng)條件。在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的人骨髓MSC體外生長的特征,用HE染色,掃描電鏡,透射電鏡等對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察。(2)對(duì)體外培養(yǎng)的人骨髓MSC進(jìn)行免疫表型鑒定,確定培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓MSC。(3)將傳代后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于去上皮的兔角膜基質(zhì)上培養(yǎng)誘導(dǎo)分化。免疫熒光檢測角膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物角蛋白12(Cytokeratin 12,CKl2)的表達(dá)。運(yùn)用體外培養(yǎng)和體內(nèi)移植的方法使種植在基質(zhì)片上的細(xì)胞復(fù)層化。待細(xì)胞融合形成單層后,置入插入式培養(yǎng)皿中進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)。4周后進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)檢測,光鏡下觀察其復(fù)層情況。體內(nèi)復(fù)層的過程中,應(yīng)用淺板層角膜移植的方法。自動(dòng)板層角膜刀做8.5mm直徑,160μm厚的豬角膜基質(zhì)片。將MSC種植在基質(zhì)片上,然后移植到去除角膜淺板層160μm厚的新西蘭大白兔的角膜基質(zhì)表面。共做3兔3只眼,4周后處死動(dòng)物,收集角膜,進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)染色檢測其復(fù)層情況。 結(jié)果人骨髓MSC可以在體外培養(yǎng)擴(kuò)增,表現(xiàn)出很強(qiáng)的增殖潛能。流式細(xì)胞儀示:培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD45陽性率為0.06%,CD34為0.41%,CD44為86.43%,CD29為85.72%,CD105為90.72%。誘導(dǎo)3周后部分細(xì)胞表達(dá)角膜上皮細(xì)胞特征性CK12。運(yùn)用氣液界面培養(yǎng)法進(jìn)行體外復(fù)層的結(jié)果顯示細(xì)胞仍為單層。體內(nèi)移植4周后細(xì)胞可以復(fù)層化,與正常角膜上皮較為相似。共做3兔3只眼,2只眼角膜植片保持透明4周,1只眼保持透明1周。 結(jié)論人骨髓MSC在體外可以成功進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng),體外培養(yǎng)的人骨髓MSC有很強(qiáng)的增殖能力。在本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)條件下,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為角膜上皮樣細(xì)胞,體內(nèi)移植可以使其復(fù)層,有可能作為角膜上皮組織工程種子細(xì)胞的選擇。
【圖文】：

!_.、卜~、，，1編月..內(nèi)口...日‘、卜_與才卜、云r，尹，圖7流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果:培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD45陽性率為0.06%，CD34為0.41%，CD44為86.43%，CD29為85.72%，CDIOS為9072%.

!_.、卜~、，，1編月..內(nèi)口...日‘、卜_與才卜、云r，尹，圖7流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果:培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD45陽性率為0.06%，CD34為0.41%，，CD44為86.43%，CD29為85.72%，CDIOS為9072%.
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2611888