【摘要】：目的：應(yīng)激是指機體在受到內(nèi)外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激時所出現(xiàn)以交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮和下丘腦－垂體－腎上腺軸激活，皮質(zhì)激素分泌增多為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，是一種全身性的非特異適應(yīng)反應(yīng)。越來越多的證據(jù)顯示應(yīng)激可以增加包括傳染性病原體導(dǎo)致的炎癥性疾病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病率。免疫系統(tǒng)作為身心關(guān)系的橋梁，其在應(yīng)激時所受到的影響越來越受到人們的重視，應(yīng)激對機體免疫功能的影響已成為目前研究的熱點之一。 應(yīng)激在功能性胃腸道疾病發(fā)病及疾病進展中的作用機制是目前基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究中的重要課題之一。應(yīng)激與多種功能性胃腸道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。胃腸道不僅是機體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的場所,也是應(yīng)激時的重要靶器官，同時還是體內(nèi)重要的免疫組織器官，發(fā)揮著重要的免疫防護作用。由完整的上皮細胞、上皮細胞刷狀緣的脂質(zhì)雙分子層以及細胞側(cè)緣由黏著連接和緊密連接構(gòu)成的細胞連接組成的腸道黏膜屏障具有機械屏障作用，可以有效阻擋病體侵入體內(nèi)，是機體固有免疫系統(tǒng)抵御外來異物入侵的第一道防線之一，腸相關(guān)淋巴組織是發(fā)生局部特異性免疫應(yīng)答的主要場所，腸黏膜固有層漿細胞產(chǎn)生的分泌型IgA使得腸道免疫成為全身免疫的一部分，存在于胃腸道的多種免疫細胞一方面通過其細胞膜上分布的多種受體接受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)，另一方面可以通過分泌多種細胞因子作用于其它免疫細胞及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。 魯比前列酮（Lubiprostone），是一種局部作用的Ⅱ型氯離子通道激活劑，最初用于治療成人慢性特發(fā)性便秘，后來又被批準(zhǔn)用于治療成人腸易激綜合征。 心理應(yīng)激導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)改變在不同的時間點，其作用模式有何不同？在慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致胃腸道疾病發(fā)生的過程中，腸道黏膜機械屏障是否受到損傷？腸道免疫屏障是否會隨之受到影響？魯比前列酮可否用于應(yīng)對心理應(yīng)激導(dǎo)致的腸道屏障異常？ 為深入研究心理應(yīng)激對機體免疫系統(tǒng)的影響，本研究以SD大鼠為研究對象，建立心理應(yīng)激動物模型，在不同時間點分別檢測心理應(yīng)激對機體全身免疫和腸道局部免疫所造成的影響，在此基礎(chǔ)上，進一步探討心理應(yīng)激導(dǎo)致腸道局部黏膜改變的靶分子，研究魯比前列酮對其發(fā)揮作用的可能性和可能的作用機制。 方法： 1影響腸道功能的心理應(yīng)激動物模型的建立及心理應(yīng)激對免疫系統(tǒng)的動態(tài)影響 我們首先建立了可以影響腸道功能的心理應(yīng)激動物模型，應(yīng)用此動物模型動態(tài)觀察在心理應(yīng)激發(fā)生的不同階段機體免疫系統(tǒng)可能發(fā)生的改變，明確心理應(yīng)激在不同時間點對免疫系統(tǒng)的影響模式。 以SD大鼠為研究對象，建立心理應(yīng)激作用動物模型，觀察心理應(yīng)激對大鼠一般狀況的影響，通過對大鼠排便情況的觀察和對內(nèi)臟敏感性的檢測明確WAS是可以影響大鼠腸道功能的心理應(yīng)激動物模型。 在不同的時間點收集大鼠血清，應(yīng)用ELISA法檢測血清中循環(huán)細胞因子IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6和TNF-α的表達水平，明確急性和慢性心理應(yīng)激對機體全身免疫可能造成的影響。 分離大鼠結(jié)腸，應(yīng)用高通量qPCR來初步篩選慢性心理應(yīng)激可能會影響的免疫分子、黏附分子、神經(jīng)遞質(zhì)等，為下一步研究指明方向。 2心理應(yīng)激對大鼠腸道局部免疫功能的動態(tài)影響 在第一部分實驗的基礎(chǔ)上，繼續(xù)應(yīng)用WAS動物模型，明確心理應(yīng)激在不同的時間點對腸道局部免疫的影響模式。 應(yīng)用實時定量PCR和Western Blot方法檢測不同的時間點局部結(jié)腸組織中IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α等細胞因子的表達水平。 應(yīng)用ELISA檢測腸液中SIgA的水平。 3慢性心理應(yīng)激及魯比前列酮對大鼠腸上皮緊密連接蛋白的改變及其作用機制 在明確心理應(yīng)激對腸道免疫系統(tǒng)的動態(tài)影響后，進一步研究慢性心理應(yīng)激及魯比前列酮對大鼠腸上皮緊密連接蛋白的改變及其作用機制。 篩選最佳的藥物作用劑量，使用該劑量在假應(yīng)激或慢性心理應(yīng)激之前給予大鼠口服魯比前列酮。連續(xù)10天WAS結(jié)束后，分離大鼠腸道上皮細胞和腸液。 應(yīng)用實時定量PCR檢測魯比前列酮對慢性心理應(yīng)激大鼠腸上皮緊密連接分子轉(zhuǎn)錄水平的影響。 應(yīng)用Western Blot檢測魯比前列酮對慢性心理應(yīng)激大鼠腸上皮緊密連接蛋白表達水平的影響。 應(yīng)用免疫熒光法檢測魯比前列酮對慢性心理應(yīng)激大鼠腸上皮緊密連接蛋白形態(tài)學(xué)的影響。 應(yīng)用ELISA檢測魯比前列酮作用后慢性心理應(yīng)激大鼠腸液中SIgA的水平變化。 結(jié)果： 1影響腸道功能的心理應(yīng)激動物模型的建立及心理應(yīng)激對免疫系統(tǒng)的動態(tài)影響 慢性心理應(yīng)激可以顯著抑制大鼠的體重增長，應(yīng)激原去除后，其抑制作用隨著時間的推移可以消失。心理應(yīng)激可以影響自主神經(jīng)系統(tǒng)對遠端結(jié)腸動力的調(diào)控，刺激大鼠排便，能夠顯著提高實驗動物的內(nèi)臟痛覺敏感。 與對照組相比，急、慢性心理應(yīng)激可以在不同時間段引起不同細胞因子在血清中的表達水平的改變，其中，1次避水應(yīng)激后1小時時大鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ顯著上升（P0.05），1次避水應(yīng)激后24小時時，IL-1β、IL-6顯著上升（P0.05），而慢性應(yīng)激對IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α表達水平的影響無顯著差異（P0.05）。 高通量篩選顯示慢性心理應(yīng)激可以導(dǎo)致結(jié)腸中多種分子轉(zhuǎn)錄水平改變，上調(diào)的主要有Adenosine A1receptor、BDNF、CCL12、CD200、Claudin2、CDK2、HDAC2、HDAC4、IL-6、Integrin-alpha M、P2RX3等，出現(xiàn)下調(diào)的有Aurora kinase A、BAZ1b、 Claudin1、Claudin6、CB2、CSF1、DMNT1、PRMT1。 2心理應(yīng)激對大鼠腸道局部免疫功能的動態(tài)影響 實時定量PCR檢測顯示急性心理應(yīng)激（1次避水應(yīng)激后1小時、24小時）及慢性心理應(yīng)激可以導(dǎo)致不同時間點不同細胞因子的mRNA水平發(fā)生改變。其中，急性、慢性心理應(yīng)激均可導(dǎo)致大鼠結(jié)腸IL-1β、IL-6表達水平上升（P0.05），1次避水應(yīng)激后1小時、24小時時大鼠結(jié)腸TNF-α表達水平上升（P0.05），1次避水應(yīng)激后24小時時大鼠結(jié)腸IL-2、IL-10表達水平上升（P0.05），慢性心理應(yīng)激對IL-2、IL-10、TNF-α和IFN-γ表達水平無顯著影響（P0.05）。 Western Blot檢測顯示急性心理應(yīng)激及慢性心理應(yīng)激均可導(dǎo)致大鼠結(jié)腸IL-1β、IL-6表達水平上升（P0.05），1次避水應(yīng)激后24小時及慢性心理應(yīng)激均可導(dǎo)致大鼠結(jié)腸IL-2表達水平上升（P0.05），急性心理應(yīng)激（1次避水應(yīng)激后1小時、24小時）后，大鼠結(jié)腸TNF-α表達水平上升（P0.05），急、慢性心理應(yīng)激對IL-10、IFN-γ的均無顯著影響（P0.05）。該結(jié)果與實時定量PCR檢測結(jié)果基本平行。 ELISA檢測顯示急性心理應(yīng)激（1次避水應(yīng)激后1小時、24小時）后，大鼠結(jié)腸腸液中SIgA水平上升（P0.05），，慢性心理應(yīng)激對腸液中SIgA的影響無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 3慢性心理應(yīng)激及魯比前列酮對大鼠腸上皮緊密連接蛋白的改變及其作用機制 首先通過對內(nèi)臟敏感性的檢測實驗確定魯比前列酮的最佳使用劑量為20μg/kg/day，每天兩次給藥。隨后應(yīng)用實時定量PCR和Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn)慢性心理應(yīng)激可以在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平顯著下調(diào)結(jié)腸上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達，鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)對照組緊密連接蛋白在上皮的頂端膜側(cè)表達，在腸上皮黏膜層分布均勻，分布廣泛，熒光信號明顯，表達量豐富，而慢性應(yīng)激組的熒光信號減弱，呈不連續(xù)分布，魯比前列酮可以部分逆轉(zhuǎn)慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致的緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin表達下降，但對ZO-1蛋白無顯著作用。慢性心理應(yīng)激可以導(dǎo)致結(jié)腸上皮細胞Claudin-2的表達出現(xiàn)上調(diào)，這種上調(diào)和ZO-1的下調(diào)一樣無法被魯比前列酮所逆轉(zhuǎn) 結(jié)論： 1慢性心理應(yīng)激可以增加大鼠腸道痛覺敏感性。 2急性心理應(yīng)激上調(diào)血清中IL-1β、IL-6的表達，急性心理應(yīng)激和慢性心理應(yīng)激均可以顯著上調(diào)腸道局部IL-1β、IL-6的表達。 3慢性心理應(yīng)激可以顯著下調(diào)結(jié)腸上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin，上調(diào)Claudin-2的表達，破壞腸道黏膜屏障。魯比前列酮可以部分逆轉(zhuǎn)慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致Claudin-1和Occludin表達下降。 4急性心理應(yīng)激可以導(dǎo)致大鼠結(jié)腸液中SIgA水平上升，慢性心理應(yīng)激和魯比前列酮對腸液中SIgA水平無顯著影響。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2609978