發(fā)布時(shí)間：2020-03-31 22:51

【摘要】：枸櫞酸鈉抗凝的富血小板血漿在二磷酸腺苷(ADP)的刺激下,可以呈現(xiàn)二相血小板聚集。一直以來(lái),這種現(xiàn)象都被歸結(jié)于低鈣環(huán)境所致的血栓烷A2的產(chǎn)生和外核苷酸酶活性的抑制。然而,凝血酶的產(chǎn)生及其在上述現(xiàn)象中的作用仍不清楚。我們通過(guò)血小板聚集儀,流式細(xì)胞儀,免疫印跡及酶聯(lián)免疫法,鑒定凝血酶在ADP引起的血小板釋放及第二相聚集中的作用及機(jī)制。結(jié)果可以概括為以下四點(diǎn)：(1)在枸櫞酸鈉抗凝的PRP中,低濃度ADP的刺激可以呈現(xiàn)典型的二相血小板聚集。凝血酶抑制劑水蛭素和PAR-1受體拮抗劑SCH-79797對(duì)ADP引起的血小板顆粒釋放及第二相聚集具有顯著且程度相似的抑制作用。(2)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示凝血酶原結(jié)合于靜息血小板表面的整合素αⅡbβ3上,在ADP的刺激下發(fā)生脫落并生成凝血酶,P13K抑制劑wortmannin可以抑制ADP引起的凝血酶原脫落及凝血酶生成。(3)通過(guò)免疫印跡,發(fā)現(xiàn)水蛭素和SCH-79797顯著降低ADP活化的晚期(180秒)Akt磷酸化水平,ADP引起的血小板釋放和第二相聚集也被wortmannin所抑制。并且,外源性加入PAR-1受體的活化肽段SFLLRN可以使被抑制的第二波聚集恢復(fù)至正常水平。(4)在存在吲哚美辛或外源性鈣離子的條件下,ADP引起的血小板活化對(duì)凝血酶及其PAR-1受體的依賴(lài)性依然存在。因此,本研究揭示了在靜息狀態(tài)下,凝血酶原結(jié)合于血小板表面的整合素αⅡbβ3上,經(jīng)ADP的刺激,P13K通路活化,凝血酶原從整合素上脫落,從而生成凝血酶。產(chǎn)生的凝血酶通過(guò)切割其PAR-1受體活化血小板,繼而引起血小板內(nèi)顆粒物的釋放,并促進(jìn)形成穩(wěn)定的第二相血小板聚集。 在臨床上,肺動(dòng)脈高壓是一種致死率極高的惡性疾病,目前依然缺乏有效的預(yù)防和治療策略。因此,很多學(xué)者把目光和希望放在了干細(xì)胞治療上。雖然有報(bào)道稱(chēng)骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞有利于修復(fù)肺動(dòng)脈高壓,但其作用機(jī)制仍處于未知。在本研究中,我們首先利用野百合堿誘導(dǎo)建立SD大鼠的肺動(dòng)脈高壓模型,3周后,模型組大鼠的右心室壓力明顯升高,右心室肥厚程度增加。大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在注射野百合堿后3天通過(guò)尾靜脈移植入大鼠體內(nèi),3周后與模型組大鼠相比,升高的右心室壓力和右心室的肥厚得到顯著緩解。其次,在體外,通過(guò)流動(dòng)小室檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞在膠原上的黏附能力,發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞不能直接與膠原黏附,而是依賴(lài)于血小板及其表面的P-選擇素和整合素αⅡbβ3。在體內(nèi),熒光標(biāo)記后的間充質(zhì)干細(xì)胞主要分布在肺部,特別是肺部的血管壁。若預(yù)先將大鼠體內(nèi)血小板的P-選擇素和整合素αⅡbβ3阻斷,移植入體內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞到肺部的歸巢被顯著抑制,并不再具有緩解肺動(dòng)脈高壓的功能。因此,本研究揭示了間充質(zhì)干細(xì)胞的移植能夠緩解肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)程,其從循環(huán)中歸巢至受損肺部的過(guò)程對(duì)于疾病的修復(fù)十分關(guān)鍵,且由血小板及其表面的P-選擇素和整合素αⅡbβ3介導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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