【摘要】：NDRG（N-Myc downstream-regulated gene）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的基因家族，該基因家族由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4組成；此基因家族成員間有57-65%氨基酸同源性，經(jīng)生物信息學(xué)分析表明，NDRG2編碼的蛋白分子內(nèi)含有一個可以攜帶�；孽；鶖y帶蛋白（ACP）結(jié)構(gòu)域和多種核轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，這是NDRG家族共同特有的結(jié)構(gòu)域。此特殊結(jié)構(gòu)或許決定了它們有著共同的表達(dá)及部分一致的功能，該基因家族參與了細(xì)胞的生長，但具體機(jī)制仍不清楚。 既往文獻(xiàn)報(bào)道NDRG家族在成年大鼠、小鼠及成人腦中都有不同程度表達(dá)；NDRG2在抑郁癥、阿爾海默氏病、應(yīng)激及缺氧時，表達(dá)異常，說明NDRG2與腦部疾病具有高度相關(guān)性；目前NDRG1、NDRG2都被稱為腦分化相關(guān)基因；NDRG4在神經(jīng)前體細(xì)胞也有較高表達(dá)，受視黃酸（RA）等因子調(diào)控；NDRG3在腦發(fā)育中表達(dá)無明確報(bào)道。因此，推測其家族在腦組織中的廣泛表達(dá)可能與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)。目前研究已經(jīng)證實(shí)，此基因家族與腫瘤細(xì)胞的異常增殖、分化密切相關(guān)，NDRG2已被明確列為抑癌候選基因。 神經(jīng)前體細(xì)胞（NPC）的正常增殖、分化、遷移對于腦的發(fā)育至關(guān)重要，但其機(jī)制還不清楚。我們在前期驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，NDRG2在小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)生區(qū)高表達(dá)，提示其可能是調(diào)控NPC增殖、分化和遷移的重要基因。但NDRG2在人腦發(fā)育中是否有相同的表達(dá)特點(diǎn)，還尚不清楚；此外，NDRG家族的4成員具有高度氨基酸同源性且在進(jìn)化中高度保守性，為了探索它們在腦發(fā)育中的作用，需首先明確其在腦內(nèi)的分布及細(xì)胞定位。 目的 通過研究NDRG2在在人胎腦及NDRG家族4個成員在小鼠生后各個腦區(qū)的表達(dá)特點(diǎn)及細(xì)胞定位，為探索NDRG家族在腦發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法 應(yīng)用免疫組化、免疫熒光、RT-PCR、Western Blot、細(xì)胞培養(yǎng)及電鏡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，，研究NDRG基因家族在不同時間點(diǎn)人胎腦和小鼠生后各腦區(qū)的表達(dá)變化及細(xì)胞定位。（1）RT-PCR法檢測NDRG2mRNA在16-28周人胎腦不同腦區(qū)中的表達(dá)；（2）Western blot技術(shù)檢測NDRG2在28周各腦區(qū)的表達(dá)；（3）免疫組織化學(xué)法檢測NDRG2在人胎腦各腦區(qū)中的表達(dá)；（4）NDRG2與GFAP或NeuN的熒光雙標(biāo)法研究其在胎腦中的細(xì)胞定位；（5）Western Blot、免疫熒光技術(shù)檢測NDRG家族4成員在出生后小鼠各腦區(qū)的表達(dá)及細(xì)胞定位；并在培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞及其分化細(xì)胞中檢測NDRG2表達(dá)情況；（6）電鏡技術(shù)檢測NDRG2的亞細(xì)胞定位。 結(jié)果 （1）通過RT-PCR、Western Blot分別在RNA和蛋白水平檢測NDRG2在不同時間點(diǎn)的人胎腦腦區(qū)表達(dá)水平的變化。隨著胎齡成熟，NDRG2表達(dá)升高，尤其在腦室下帶、腦室管膜區(qū)域表達(dá)最為突出；（2）免疫組化從細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證了NDRG2主要在人胎腦腦室下帶、腦室管膜表達(dá)；免疫熒光雙標(biāo)還明確了NDRG2可表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和相對成熟的神經(jīng)元中，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，極少數(shù)星型膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核也有表達(dá)；（3）用Western Blot明確了NDRG1-4成員在出生后小鼠不同時間點(diǎn)、不同腦區(qū)表達(dá)特征：21天鼠腦海馬區(qū)、腦室下帶等神經(jīng)發(fā)生區(qū)NDRG2有特異表達(dá)；在120天小鼠，表達(dá)明顯減弱；NDRG1、3、4在腦室下帶、海馬亦有表達(dá)，但無明確規(guī)律；（4）免疫熒光顯示NDRG1、3、4在出生后神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)生區(qū)無表達(dá)，NDRG2在小鼠腦海馬區(qū)以星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿特異性表達(dá)為主。NDRG2在培養(yǎng)分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿表達(dá)；（5）在NDRG2在亞細(xì)胞定位研究中，發(fā)現(xiàn)NDRG2表達(dá)在神經(jīng)前體細(xì)胞及分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體嵴和包膜上。 結(jié)論 （1）NDRG2在人胎腦腦功能區(qū)表達(dá)廣泛；隨著胎齡成熟，表達(dá)增強(qiáng)；在神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)生區(qū)最強(qiáng)，說明NDRG2與細(xì)胞增殖、分化及成熟密切相關(guān)。 （2）NDRG家族在出生后鼠腦區(qū)表達(dá)有明確區(qū)別，NDRG2主要表達(dá)于神經(jīng)發(fā)生區(qū)，NDRG1、3、4在神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)生區(qū)參與了分化，但與神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)生無特異性關(guān)系。 （3）NDRG2可能通過影響神經(jīng)前體細(xì)胞的線粒體功能調(diào)控其增殖、分化過程。
【圖文】：

弱 NDRG3 表達(dá)。另外 NDRG3 與 NDRG2 一樣在生殖系統(tǒng)的精子發(fā)育成揮著重要作用 [25,26,27,28]。NDRG4 基因位于染色體 16q21~q22.3,跨度 26 kb,包含 17 個外顯子,包括A 亞型序列(NDRG4-B、NDRG4-Bvar、NDRG4-H)。NDRG4 基因位于 16q2 39kb，由 19 個外顯子組成。選擇性啟動子作用于不同部位可產(chǎn)生三：NDRG4-A，NDRG4-B，NDRG4-C。每一個都含有一個缺少 18 號外 ， 因 此 NDRG4-A1, NDRG4-A2, NDRG4-B1, NDRG4-B2, NDRG4G4-C2 被分別表達(dá)。這六個變種可以解釋 NDRG4 蛋白在腦組織中的異 18 號外顯子的蛋白出現(xiàn)在胚胎和出生后腦組織中，而含有 18 號外顯子人的腦組織中表達(dá)[28]。在 NDRG4 三種亞型中；僅 NDRG4-B 在腦組織中G4-H 在大腦和心臟中均有表達(dá)，而 NDRG4-B（var）只是副產(chǎn)物。ND腦組織和心臟中表達(dá)比兒童豐富，且在阿爾茨海默氏病中表達(dá)明顯下降顯示 NDRG4 在腦神經(jīng)元和臍帶中表達(dá)[29]。（附圖 3）

這里的神經(jīng)前體細(xì)胞 (NPC)屬于具有自我增殖且具多種分化潛能的干細(xì)胞[32],增殖、分化后，跨過中間帶(IZ)，沿暫時存在的輻射狀膠質(zhì)細(xì)胞的纖維遷移到固定細(xì)胞層，并最終分化為具有各自功能的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞[102]附圖1、2。圖1 大腦皮層發(fā)育示意圖
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R338

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本文編號：2608856