【摘要】：同種異體移植已在臨床廣泛開展，并成為根治許多終末期器官功能衰竭疾病的唯一手段。目前面臨的問題是：人器官移植物來源十分有限，且獲得供體的時機極為隨機，，以至臨床需求缺口日益擴大，并成為制約臨床開展移植術的主要因素。為解決供體器官嚴重短缺的難題，應用異種動物(主要是豬)為供體的異種移植成為近年移植免疫學領域的研究熱點之一。 由于靈長類動物(包括人)體內(nèi)存在針對豬組織細胞表面α-半乳糖苷的天然抗體，故豬→人異種移植中，人天然抗體可與豬組織細胞表面抗原結合，通過激活補體而導致供者移植物細胞溶解，并引發(fā)超急性排斥反應。國內(nèi)外均已報道：通過抑制受者補體系統(tǒng)激活等手段，可成功克服超急性異種移植排斥反應。因此，異種移植后的急性血管性排斥反應和急性細胞性排斥反應成為人們關注的重點。目前有關異種移植的實驗研究主要集中于如下領域：①豬的主要組織相容性復合體(SLA)；②NK細胞ADCC效應對異種靶細胞的殺傷作用，以及人CD4~+和CD8~+T細胞介導異種細胞移植排斥反應的機制。 本課題分析中國豬種SLA基因結構特征，以及人NK細胞殺傷異種靶細胞過程中的胞吐作用及其機制，其立題依據(jù)是： 1．豬MHC(SLA)分子是引發(fā)急性和慢性異種移植排斥反應的關鍵抗原，分析比較SLA與人HLA復合體遺傳結構的異同，有助于探討異種移植排斥反應的發(fā)生機制，并為選擇豬種和制定臨床干預方案提供重要線索。 2．人NK細胞是參與異種移植排斥反應的重要效應細胞，其被靶細胞(即豬血管內(nèi)皮細胞)觸發(fā)，通過殺傷性胞吐(脫顆粒)過程而釋放顆粒酶、穿孔素等，可對豬血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮殺傷效應，此乃豬→人異種器官移植急性排斥反應中最早發(fā)生和最關鍵的病理過程。 一、異種移植備選中國豬種的經(jīng)典SLA基因序列分析 近二十余年，國外已分析了多個實驗豬種的SLA復合體及其抗原系統(tǒng)，為探討人類免疫系統(tǒng)識別SLA抗原的機制奠定了理論基礎。 我國是豬種資源最為豐富的國家，豬種遺傳性狀穩(wěn)定，為篩選合適的供體豬種提供了有利條件。為探討我國豬種SLA基因結構及其在豬→人異種器官移植中的作用，本 課題選擇中國不同地區(qū)3個常見實驗用豬種—湖北中華大白豬封閉群、海南五指山豬 近交系和云南版納小耳豬近交系為研究對象，根據(jù)Genbank中NIH小型豬SLAI類和 n類基因序列設計引物，采用RT一PCR方法獲得相應基因的cDNA產(chǎn)物，電泳鑒定后純 化，對PCR產(chǎn)物進行直接測序或克隆入測序T載體后進行雙向測序，獲得中國豬種SLA I類和n類基因cDNA序列，進而借助DNA Tools 5.0軟件包和GCG Ver. 2.9軟件包進 行相關比較和分析。本課題的實驗結果為: 1 .3個中國豬種SLA一DRA基因為高度保守序列，無多態(tài)性，與NIH小型豬在核 昔酸和氨基酸水平的同源性均為100%;3個中國豬種其他的經(jīng)典SLAI類和n類基因 (PI、P14、DQA、DQB、D鄧)均具多態(tài)性，與NIH小型豬在核昔酸水平同源性高 于90%，在氨基酸水平同源性高于87%。結果提示:受試中國豬種Pl、P14、DQA、 DQB、DRB基因分別為相應基因座位上的新等位基因。 2.中國人群中HLAI類高頻等位基因HLA一A*0 201與中國豬種P1和P14基因產(chǎn) 物的氨基酸序列同源性僅為63%，但在MHC分子多態(tài)樣al和a2功能區(qū)中與抗原膚錨 著位相對應的位點，其氨基酸殘基基本相同。結果提示:不同種屬動物MHC分子膚結 合區(qū)的差異較小，具有一定保守性。 3 .SLA一Pl、SLA一P14和HLA一A*0201產(chǎn)物中參與同人CDS結合所必需的關鍵氨 基酸殘基，僅有兩個存在差異，即:第223位丙氨酸(Ala)變?yōu)槔U氨酸(Val);第 235位丙氨酸(Ala)變?yōu)橘嚢彼?Lys)。SLA一Pl、SLA一P14和HLA一A*0201產(chǎn)物中參 與同人CDS結合所必需的關鍵氨基酸殘基的高度相似性，提示SLAI類分子可跨越種 屬界限而與人CDS分子結合，從而發(fā)揮相應生物學作用。 4.兩個近交系豬種SLA一DRA和人HLA一DRA產(chǎn)物與CD4分子結合所必需的關鍵 氨基酸殘基基本相同，僅在兩個位點發(fā)生相同變異，即:第125位精氨酸(Arg)變?yōu)?甘氨酸(Gly);第129位擷氨酸(Val)變?yōu)楫惲涟彼?I le)。而SLA一DRB分子參與 結合CD4所必需的關鍵氨基酸殘基與人類完全相同，此現(xiàn)象在國內(nèi)外其他豬種SLA序 列研究中尚未見報道。上述結果，即SLAn類分子和人HLAn類分子結構具有高度相 似性，進一步提示:中國豬種SLAH類分子可跨越種屬界限而與人CD4分子結合，并 發(fā)揮相應生物學作用。 5.中國豬種SLAI類分子(P1和P14)缺乏與NK細胞表面殺傷細胞抑制性受體 (KIR)結合的關鍵氨基酸殘基。提示:由于缺乏KIR的配基序列，中國豬種組織細胞 難以啟動NK細胞的負調(diào)節(jié)信號，故豬源移植物易遭人(受者)NK細胞殺傷。由此， 本課題從新的角度闡明了豬~人異種移植中豬源組織細胞受損的可能機制。 綜上所述，通過在分子遺傳學水平分析、比較SLA和HLA基因結構，發(fā)現(xiàn)海南五 指山豬近交系和云南版納小耳豬近交系SLA與人HLA遺傳背景具有高度相似性，但兩 個中國豬種相關基因序列發(fā)生變異的氨基酸殘基與NIH小型豬有所不同。本課題獲得 了中國主要實驗豬種SLA基因結構的初步信息，通過進一步闡明所發(fā)生變異的確切生 物學作用，可望為中國豬種用于人類
【圖文】：

圖1Figl湖北中華大白豬封閉群SLA經(jīng)典I類基因(Pl)RT一PCR產(chǎn)物電泳結果AgarosegelelectroPhoresisanalysisofRT一PCRProduetsofelassiealSLA一PIgeneinHubeiWhitePigs泳道1:PCR產(chǎn)物分子量標準Lanel:PCRMarker泳道2一n:樣本LaneZ一11:thesamPles圖2顯示對P14基因RT一PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳的結果:泳道1為PCR產(chǎn)物分子量標準:泳道2至泳道11為10例不同個體樣本P14基因RT一PCR擴增產(chǎn)物，各泳道均可見一條清晰的特異性擴增條帶，片段大小約為1.Ikb。圖2湖北中華大白豬封閉群SLA經(jīng)典I類基因(P14)RT一PCR產(chǎn)物電泳結果Fig2AgarosegeleleetroPhoresisanalysisofRT一PCRProduetsofelassiealSLA一P14geneinHubeiWhitePigs泳道1:PCR產(chǎn)物分子量標準Lanel:PCRMarker泳道2一11:

泳道2一n:樣本LaneZ一11:thesamPles圖2顯示對P14基因RT一PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳的結果:泳道1為PCR產(chǎn)物分子量標準:泳道2至泳道11為10例不同個體樣本P14基因RT一PCR擴增產(chǎn)物，各泳道均可見一條清晰的特異性擴增條帶，片段大小約為1.Ikb。圖2湖北中華大白豬封閉群SLA經(jīng)典I類基因(P14)RT一PCR產(chǎn)物電泳結果Fig2AgarosegeleleetroPhoresisanalysisofRT一PCRProduetsofelassiealSLA一P14geneinHubeiWhitePigs泳道1:PCR產(chǎn)物分子量標準Lanel:PCRMarker泳道2一11:LaneZ一11:樣本thesamPles
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2608463