【摘要】： 基因治療的興起為人類徹底克服惡性腫瘤等疾病帶來了新的希望，但 現(xiàn)有的腫瘤基因治療方案多存在治療效率低、特異性不強等問題。細胞凋 亡是機體細胞在生長發(fā)育中或病理狀態(tài)下存在的一種自發(fā)的程序化的死 亡過程。半胱天冬酶（caspase）的切割活化是不同細胞凋亡途徑中共同的 下游事件。Caspase在細胞中以酶原形式存在，活化后作用于多種蛋白質(zhì) 底物，引起細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡最重要的執(zhí)行分子之一，它 的活化可以高效地不可逆地誘導(dǎo)細胞凋亡，活性caspase-3特異性地作用 于腫瘤細胞，將有助于提供一種高效低毒的腫瘤基因治療新途徑。 研究表明，將caspase-3的大小亞基顛倒可以得到具有天然活性的 caspase分子（revcasp-3），我們在這種revcasp-3的N端融合來源于綠膿桿 菌外毒素（Pseudomonas exotoxin A，PE）轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域的部分序列（253-412 或253-364位氨基酸），構(gòu)建了4種caspase-3融合蛋白（Fcasp-3），其中2 種在PE序列和revcasp-3之間加有caspase-3識別并可能切割的氨基酸序 列（IETD），在此基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建了PE 253-279位氨基酸截短的融合 蛋白，，稱為“重構(gòu)型caspase-3”（Rcasp-3）。4種重構(gòu)型caspase-3瞬時表 達于人宮頸癌HeLa等細胞中，倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染 細胞生活力下降，大多數(shù)細胞發(fā)生死亡，Western blot證實了它們對多聚 賈林濤 第 四 軍 醫(yī) 大學(xué)博士學(xué)位論文 ADP核糖基化酶（PAny）的切割作用，MH法檢測表明，4種 Rcasp上 具有與 revcasp3相似的促進細胞死亡的活性，其中 N端融合 PE aa280上64 的Rcaspl較之融合PE aa 280A 的Rcasp3活性略強，而PE序列和 rCvcasp3之間IETD識別位點的存在對RCCp3活性基本沒有影響；建立 了Rcasp－3誘導(dǎo)表達HeLa細胞系，蛻皮素誘導(dǎo)后迅速導(dǎo)致細胞死亡，各 組細胞死亡率大小與瞬時轉(zhuǎn)染MTT檢測結(jié)果完全一致。測定不含IETD 的Rcasp3誘導(dǎo)表達后的細胞周期，發(fā)現(xiàn)它們在誘導(dǎo)后24h均出現(xiàn)凋亡峰， 同時細胞在電鏡下呈現(xiàn)膜出泡、染色質(zhì)固縮、凋亡小體形成等典型的凋亡 細胞的特征。這些結(jié)果表明，重構(gòu)型caspase上均能有效地誘導(dǎo)腫瘤細胞 凋亡，N端外源肽段的存在對revcasp3的促凋亡活性影響不大，而IETD 識別位點對revcasp3活性的影響更是可以忽略。 進一步將抗腫瘤特異性抗原HERZ單鏈抗體e23sFv、PE轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域 和revc卿〕的基因連接，并在了端連有前導(dǎo)肽基因，構(gòu)建了Ernmunocasp3 基因，該基因轉(zhuǎn)化人淋巴瘤Jurkat細胞，細胞計數(shù)顯示轉(zhuǎn)化細胞具有正常 的生長曲線，RT－PCR 和ELISA 證實它們可以通過分泌途徑產(chǎn)生 inununocasn3融合蛋白，后者可以特異性地識別HERZ陽性腫瘤細胞，并 轉(zhuǎn)位至細胞漿中，在 PE Arg279和 Gly280間發(fā)生斷裂，釋放出業(yè)己被證 明具有自發(fā)活性的重構(gòu)型c卿ase上，高效地誘導(dǎo)細胞凋亡。我們通過體外 共培養(yǎng)實驗證實了immunocasp3基因轉(zhuǎn)化的淋巴細胞對HERZ陽性腫瘤 細胞的殺傷作用，DNA梯狀電泳條帶實驗證實這種殺傷是基子內(nèi)化進入 腫瘤細胞的irnmunocasp3蛋白的促凋亡作用。 由于被irnmtinocasp3基因修飾的淋巳細胞本身功能正常，回輸這種 細胞將可以持續(xù)分泌效應(yīng)蛋白，加之caspase是細胞凋亡的直接執(zhí)行者， 因此對腫瘤細胞的殺傷作用效率更高；Inununocasp3效應(yīng)分子通過抗體特 異性地識別腫瘤細胞，同時，二種inununocasp3均在N端融合長的抗體 和PE序列，而且它們之間沒有可能發(fā)生切割斷裂的位點，因而推測融合 蛋白在通過血液轉(zhuǎn)移過程中和進入腫瘤細胞前，由于不能正確折疊而不具 有 CAspAnC3的活性。另外，im側(cè)�！眕3主要由人源化抗體和人自身蛋 白構(gòu)成，不會誘發(fā)體內(nèi)強烈的排異反應(yīng)，而且細胞發(fā)生凋亡時不引起炎癥 反應(yīng)，所以治療的毒副作用較小。本研究可望為HERZ陽性腫瘤的靶向基 4 賈林濤 第 四 軍 醫(yī) 大學(xué)博士學(xué)位論文 因治療提供一種新思路。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：Q785

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 關(guān)健;胡桃醌體外誘導(dǎo)LS-174T細胞凋亡機制的初步研究[D];黑龍江大學(xué);2010年

本文編號：2608380