發(fā)布時(shí)間：2020-03-30 05:44

【摘要】：以酶為靶點(diǎn)的新藥開(kāi)發(fā)存在巨大潛力,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,提出了更多基于特異性酶抑制劑的藥物研發(fā)需求。駱駝體內(nèi)存在一種重鏈抗體HCAb,盡管缺失輕鏈和傳統(tǒng)抗體重鏈中的CH1恒定區(qū),卻仍具有良好的穩(wěn)定性和正常識(shí)別抗原的能力,而且重鏈抗體的可變區(qū)CDR3較傳統(tǒng)抗體相應(yīng)區(qū)域要長(zhǎng),較長(zhǎng)的CDR3可形成穩(wěn)定的大凸環(huán)結(jié)構(gòu),可優(yōu)先結(jié)合酶活性中心位點(diǎn)。通過(guò)基因工程技術(shù)克隆自駱駝HCAb可變區(qū)的VHH單域抗體,已證實(shí)可在大腸桿菌和酵母細(xì)胞中高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分子量小,可溶性好,穩(wěn)定性強(qiáng),免疫原性弱,組織穿透性好,可作為治療性酶抑制劑的最佳候選。 雙峰駝(Camelus bactrianu)主要分布在我國(guó)新疆、青海、內(nèi)蒙古、甘肅等西部地區(qū)及蒙古國(guó),目前還未見(jiàn)雙峰駝VHH抗體文庫(kù)的相關(guān)報(bào)道。本文采用重鏈抗體鉸鏈特異引物,從蒜氨酸酶免疫的雙峰駝外周血淋巴細(xì)胞中,克隆獲得兩類(lèi)不同亞型重鏈抗體IgG2a及IgG3的VHH片段,大小在400 bp~600 bp之間。再將擴(kuò)增獲得的VHH抗體片段連接至噬菌粒pCANTAB 5E表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1,構(gòu)建獲得庫(kù)容為2.8×105cfu的VHH抗體庫(kù),以M13KO7輔助噬菌體感染擴(kuò)增獲得噬菌體展示VHH單域抗體庫(kù),利用該展示技術(shù)將VHH片段與噬菌體衣殼蛋白融合表達(dá)于噬菌體表面,通過(guò)三輪生物親和淘洗,從中初步篩選獲得具有蒜氨酸酶特異結(jié)合活性的單域抗體片段VHH A4進(jìn)行原核表達(dá)并純化,經(jīng)Western blot免疫印跡驗(yàn)證蒜氨酸酶的特異結(jié)合活性,酶抑制活性分析顯示VHH A4 IC50值約為20 nmol/L,具有顯著的酶抑制活性,表明來(lái)自雙峰駝HCAb可變區(qū)的單域抗體庫(kù)可作為潛在酶抑制劑的篩選平臺(tái)。由于蒜氨酸酶可催化蒜氨酸產(chǎn)生大蒜素從而對(duì)腫瘤具殺傷功效,篩選獲得蒜氨酸酶抑制劑對(duì)蒜氨酸酶抗體酶制備及其定向腫瘤治療具有重要意義。
【圖文】：

僅為常規(guī)抗體的 1/10，其分子高度 4.8nm，直徑 2.2nm，，故米抗體（nanobody）。VHH 抗體重要的特征之一是其具有更為合區(qū)（CDR），可結(jié)合一些常規(guī)抗體無(wú)法接近的抗原表位。如的活性中心結(jié)構(gòu)。另外，它還具有易表達(dá)，水溶性好，穩(wěn)定織穿透性好等優(yōu)點(diǎn)，使得該抗體作為一種小型化的基因工程藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。目前基于駱駝重鏈抗體究在歐美地區(qū)已開(kāi)始成為熱點(diǎn)之一，但在國(guó)內(nèi)仍鮮見(jiàn)報(bào)道。新主要產(chǎn)地之一，對(duì)于雙峰駝中重鏈抗體的研究，可為研發(fā)新型便利，也為進(jìn)一步了解該型抗體在駱駝免疫中的作用提供線來(lái)源于駱駝重鏈抗體的單域抗體在國(guó)內(nèi)外的應(yīng)用研究現(xiàn)狀展即將開(kāi)展的基因工程抗體改造及其在免疫治療方面的應(yīng)用工

抗原特異雙峰駝單域抗體及其抗體相關(guān)功能研究提供前期粒B 5E 噬菌粒改造載體和大腸桿菌 TG1 由中國(guó)科學(xué)院生物，M13KO7 輔助噬菌體購(gòu)自 Amersham Biosciences 公司。p 1，其中 pCANTAB 5E 中的 NotⅠ酶切位點(diǎn)被刪除，換成 GGCCTCGGGGGCC，fd3 基因編碼噬菌體 g3p 衣殼蛋白。
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2607130