【摘要】：心腦血管血栓性疾病是人類的近年面臨的頭號(hào)殺手。溶栓和抗凝藥物組合應(yīng)用是臨床治療血栓疾病主要給藥方案,出血傾向是血栓治療的主要副作用。為提高葡激酶的選擇性、降低葡激酶的臨床用藥量,同時(shí),降低水蛭素在非血栓部位的濃度或活性從而減小出血的危險(xiǎn),我們利用水蛭素對(duì)凝血酶的高親和性和N—末端延伸引起活性降低的特性,首次設(shè)計(jì)并構(gòu)建了通過含有凝血因子FXa識(shí)別的六肽連接的葡激酶與水蛭素的融合蛋白,使之具有靶向溶栓抗凝雙功能和減小出血傾向等特性。 融合蛋白在畢赤酵母中表達(dá)時(shí),葡激酶因第28位天冬酰氨被糖基化而失去活化纖溶酶原活性。Val_(29)突變?yōu)镻ro的突變體(V29P)基因構(gòu)建到pPIC9K載體并在甲醇利用型畢赤酵母中得到高效分泌表達(dá),甲醇誘導(dǎo)96h,搖瓶發(fā)酵表達(dá)量達(dá)到1g/L,發(fā)酵上清液目的蛋白含量占總蛋白的70%以上,第28位天冬酰氨不發(fā)生糖基化;但表達(dá)產(chǎn)物不可逆地喪失葡激酶的活化纖溶酶原活性。研究還表明,葡激酶的Asn28、Thr30分別突變?yōu)镚ln、Ile的突變體均完全喪失活性。計(jì)算分析表明,所突變的三個(gè)氨基酸使得葡激酶的β折疊結(jié)構(gòu)受到破壞,影響了葡激酶與纖溶酶原的結(jié)合,從而使之活性喪失,同時(shí)表明SAK的24至30位氨基酸殘基形成的β折疊結(jié)構(gòu)對(duì)維持其活性和功能是必需的。 將融合蛋白基因克隆到pBV220載體并在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)。融合蛋白以可溶性蛋白的形式存在與大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中,采用反復(fù)凍融提取、離子交換和凝膠過濾方法純化了目的蛋白,純度達(dá)96%以上。① 融合蛋白對(duì)凝血酶具有一定的靶向性② 完整的融合蛋白具有顯著的溶栓功能,喪失抗凝活性,從而可減小出血傾向;但融合蛋白在FXa作用下發(fā)生裂解,從而釋放出游離水蛭素具有抗凝功能,表明融合蛋白可在血栓部位具有靶向溶栓抗凝雙功能。③ 采用卡拉膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明,融合蛋白組小鼠尾部血栓較葡激酶組明顯降低,同時(shí)尾部血栓形成頻率也明顯減少,表明融合蛋白具有更好的抗血栓效果。融合蛋白具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R341

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2 陳U，

本文編號(hào)：2606510