【摘要】： 目的 建立人胎兒角膜上皮細胞體外原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)方法,優(yōu)化人胎兒角膜上皮細胞的培養(yǎng)體系,為構建組織工程角膜提供上皮種子細胞。 方法 一、人胎兒角膜上皮原代和傳代培養(yǎng) 1、原代培養(yǎng) 嚴格無菌操作獲取人胎兒角膜片,采用組織塊貼壁法(角膜緣部、中央部)、酶消化法原代培養(yǎng)人胎兒角膜上皮細胞。 2、傳代培養(yǎng) 角膜緣部的細胞生長融合達80%以上,不同稀釋濃度的胰酶/EDTA消化液消化傳代分別接種于空板、小鼠3T3成纖維細胞飼養(yǎng)層、胎兒角膜基質細胞飼養(yǎng)層及HTK飼養(yǎng)層,培養(yǎng)液分別采用D/F12、小鼠3T3成纖維細胞條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質細胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液。 二、人胎兒角膜上皮細胞培養(yǎng)體系的條件優(yōu)化 1、三種條件培養(yǎng)液蛋白含量測定與細胞增殖檢測 將收集的小鼠3T3成纖維細胞條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質細胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液使用BCA蛋白定量試劑盒測定樣品的蛋白含量。 設D/F12為對照組,MTT法檢測3T3條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質細胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液對人角膜上皮細胞系的增殖能力。 2、牛角膜細胞破碎液蛋白含量測定與細胞增殖檢測 將收集的牛角膜上皮細胞、基質細胞及內皮細胞三種細胞破碎液原液使用BCA蛋白定量試劑盒測定樣品的蛋白含量。設D/F12為對照組,MTT法檢測含5%、10%、20%不同濃度的三種牛角膜細胞破碎液對人角膜上皮細胞系的增殖能力。 三、人胎兒角膜上皮細胞的性質鑒定 將P3代人胎兒角膜上皮細胞用K3/12抗體進行熒光染色,觀察傳代細胞是否還保持有角膜上皮細胞的特性。 收集P3代人胎兒角膜上皮細胞總RNA,用角膜基質細胞作為陰性對照,檢測K12、Pax6、K15、ABCG2和P75在mRNA水平上的表達情況。 結果 一、人胎兒角膜上皮細胞的生長情況觀察 1、原代培養(yǎng) 角膜緣部組織塊周圍遷出的細胞以圓形或卵圓形為主,排列緊密,生長狀態(tài)良好;中央部的角膜上皮細胞體積大,以大而扁平的類表層上皮細胞為主,生長狀態(tài)差;消化法培養(yǎng)可觀察到上皮消化成單細胞懸液,但接種后無細胞貼壁。 2、細胞傳代 觀察不同濃度消化液消化傳代的細胞發(fā)現(xiàn),采用0.05%胰酶+0.02%EDTA消化可觀察到消化后的細胞大部分成單細胞狀態(tài),傳代培養(yǎng)后細胞貼壁及增殖良好。 接于HTK飼養(yǎng)層和胎兒角膜基質細胞飼養(yǎng)層上的細胞不易貼壁且細胞不增殖,接于3T3飼養(yǎng)層上的細胞克隆生長,增殖能力強,但繼續(xù)傳代后細胞老化,不再增殖,容易有角膜基質細胞污染。 采用D/F12、HTK條件培養(yǎng)液及胎兒角膜基質細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng),細胞增殖能力弱,逐漸老化,不能繼續(xù)傳代;采用3T3條件培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)3天后,可見形態(tài)規(guī)則的卵圓形小細胞集落分布于不規(guī)則的大細胞間,細胞增殖能力強。傳至P4代胎兒角膜上皮細胞仍有較強增殖能力,但小細胞明顯減少。 二、人胎兒角膜上皮細胞培養(yǎng)體系的條件優(yōu)化 1、三種條件培養(yǎng)液對人角膜上皮細胞增殖的影響 用BCA蛋白定量試劑盒對3T3條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質細胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液進行蛋白含量測定,結果顯示3T3條件培養(yǎng)液組蛋白含量最高。 MTT法檢測結果顯示3T3條件培養(yǎng)液可明顯促進HCEC的增殖,其與胎兒角膜基質細胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液和D/F12三組差異均有顯著的統(tǒng)計學意義。 2、三種牛角膜細胞破碎液對人角膜上皮細胞增殖的影響 用BCA蛋白定量試劑盒對牛角膜上皮、基質及內皮細胞破碎液液體進行蛋白含量測定,結果顯示牛角膜上皮細胞破碎液為914μg/ml,牛角膜基質細胞破碎液為953μg/ml,牛內皮細胞破碎細胞液為1252μg/ml。 MTT法檢測結果顯示5%的牛上皮細胞破碎液、5%、10%�；|細胞破碎液、10%牛內皮細胞破碎液均可明顯促進HCEC的增殖,四組與D/F12之間差異有顯著的統(tǒng)計學意義,四組間差異無統(tǒng)計學意義。 三、人胎兒角膜上皮細胞的性質鑒定 1、免疫熒光染色可見P3代的人胎兒角膜上皮細胞K3/12染色陽性。 2、RT-PCR檢測顯示,P3代人胎兒角膜上皮細胞在mRNA水平上有K12、K15、Pax6、P75和ABCG2的高表達,而角膜基質細胞表達較弱。 結論 一、組織塊貼壁法原代培養(yǎng)人胎兒角膜上皮細胞以及小鼠3T3成纖維細胞條件培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)方法基本建立; 二、人胎兒角膜緣部上皮細胞增殖能力優(yōu)于中央部; 三、3T3細胞條件培養(yǎng)液能促進角膜上皮細胞的增殖。
【圖文】：

圖5人胎兒角膜上皮細胞在3T3飼養(yǎng)層上傳代生長情況a為P1代人胎兒角膜上皮細胞在3T3飼養(yǎng)層上生長狀態(tài):克隆團不斷增殖，推擠飼養(yǎng)層細胞而匯合x100b為PZ代人胎兒角膜上皮細胞在3T3飼養(yǎng)層上生長狀態(tài):細胞增殖極緩，，細胞老化X100

圖5人胎兒角膜上皮細胞在3T3飼養(yǎng)層上傳代生長情況a為P1代人胎兒角膜上皮細胞在3T3飼養(yǎng)層上生長狀態(tài):克隆團不斷增殖，推擠飼養(yǎng)層細胞而匯合x100b為PZ代人胎兒角膜上皮細胞在3T3飼養(yǎng)層上生長狀態(tài):細胞增殖極緩，細胞老化X100
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 霍龍;張巖;吳應積;;微滴培養(yǎng)技術的新應用[J];生物技術通報;2011年09期

2 吳衛(wèi)妮;任妮;王志豪;范潔;徐永平;;山羊背根神經節(jié)神經細胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J];中國獸醫(yī)科學;2011年09期

3 于國華;孔令玲;曲桂梅;馮國營;姚衛(wèi)東;林春華;;人腎間質成纖維細胞體外增殖及膠原的合成[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年20期

4 李洪偉;郭開今;周冰;辛兵;陳向陽;葛保健;;人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)及其生物學特性分析[J];山東醫(yī)藥;2011年26期

5 李玉;但齊琴;習楊彥彬;;成年小鼠海馬神經細胞培養(yǎng)及其鑒定[J];昆明醫(yī)學院學報;2011年06期

6 羅燕;趙宗勝;谷新利;邵永斌;時敏;;綿羊肌內前體脂肪細胞的體外培養(yǎng)[J];石河子大學學報(自然科學版);2011年03期

7 宋芹;陳封政;顏軍;郭曉強;鄔曉勇;姚倩;茍小軍;;一種膠原蛋白寡肽對人皮膚成纖維細胞增殖及膠原分泌的影響[J];成都大學學報(自然科學版);2011年02期

8 何懿;欒杰;;PDMS微孔陣列細胞培養(yǎng)實驗平臺的初步構建與評測[J];組織工程與重建外科雜志;2011年03期

9 趙麗輝;張一折;杜娟;韓德明;田堅;孫秀平;;毛節(jié)纈草抗抑郁和抗腫瘤活性組分的研究[J];東北師大學報(自然科學版);2011年03期

10 李威;季小彬;叢晶;吳效科;;甘草次酸、水飛薊賓對體外培養(yǎng)的胰島素抵抗豬卵巢顆粒細胞的影響[J];科技導報;2011年19期

相關會議論文 前10條

1 趙冬梅;金帆;黃荷鳳;;小鼠植入前胚胎GCN5和HDAC1表達模式及體外培養(yǎng)對其表達影響[A];2005年浙江省婦產科學暨計劃生育學術會議論文匯編[C];2005年

2 戴國;朱文彪;汪保和;;AcSDKP抑制體外培養(yǎng)條件下人骨髓間充質干細胞的增殖及作用機理研究[A];湖南省生理科學會2006年度學術年會論文摘要匯編[C];2007年

3 詹華強;蔡智仁;劉大偉;張穎嫻;鄭玉忠;朱悅;畢文川;詹雅嫻;郭江揚;徐麗;付強;張倩;董婷霞;;中藥黃酮對體外培養(yǎng)的神經細胞具有神經保護功效——預防老年癡呆癥的健康食品滋補劑的研發(fā)(摘要)[A];全國第9屆天然藥物資源學術研討會論文集[C];2010年

4 張海燕;李衛(wèi)紅;李玉晶;劉曉勇;劉俊;葛麗華;;體外培養(yǎng)人牙髓細胞的生物學特征[A];中國細胞生物學學會第七次會議論文摘要匯編[C];1999年

5 劉開泰;馬麗英;張永亮;李靈芝;王國荃;;氟對體外培養(yǎng)長骨形態(tài)結構和生化指標的影響[A];新世紀預防醫(yī)學面臨的挑戰(zhàn)——中華預防醫(yī)學會首屆學術年會論文摘要集[C];2002年

6 熊曉云;鄒永;吳玉梅;朱杰;梅其炳;;三種阿爾茨海默癥治療藥物促體外培養(yǎng)小鼠皮層神經元活性的比較[A];中國藥理學會第八次全國代表大會論文摘要集（第二部分）[C];2002年

7 曹榮;王加啟;胡菡;卜登攀;雒秋江;;1，25-(OH)_2D_3對體外培養(yǎng)圍產期奶牛外周血淋巴細胞轉化率及γ-干擾素(IFN-γ)的影響[A];中國奶牛協(xié)會2007年會論文集（上冊）[C];2007年

8 采克俊;丁海雷;丁志麗;張易祥;張念慈;劉莉;;雞精原干細胞分離與體外培養(yǎng)的初步研究[A];中國細胞生物學學會第九次會員代表大會暨青年學術大會論文摘要集[C];2007年

9 張林;郝兆芹;;陽離子聚合物介導的外源基因對體外培養(yǎng)的兔角膜內皮細胞生長影響的研究[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術大會論文匯編[C];2007年

10 葛紅巖;殷秀麗;付安安;尚魏;;RGD肽對體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞黏附與增殖作用的影響[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術大會論文匯編[C];2007年

相關重要報紙文章 前10條

1 辛綜;體外培養(yǎng)卵細胞生存長達24小時[N];科技日報;2002年

2 林黎民;丙肝病毒體外培養(yǎng)獲成功[N];中國醫(yī)藥報;2002年

3 姜瑞;我國肌腱體外培養(yǎng)再植研究取得重大進展[N];醫(yī)藥經濟報;2006年

4 聶松義;脊髓損傷截癱治療現(xiàn)曙光[N];中國醫(yī)藥報;2001年

5 ;我國科學家成功地在體外培養(yǎng)出神經干細胞[N];中國高新技術產業(yè)導報;2001年

6 記者 閻新華;我科學家率先在體外培養(yǎng)成功胃腸器官[N];科技日報;2001年

7 記者羅冰;人胚心臟體外培養(yǎng)成功[N];科技日報;2003年

8 記者胡德榮;心肌細胞能體外培養(yǎng)[N];健康報;2002年

9 吳一福;聽囊細胞體外培養(yǎng)獲成功[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 ;無糖對體外培養(yǎng)的神經前體細胞損傷的影響[N];中國醫(yī)藥報;2003年

相關博士學位論文 前10條

1 王國超;褐飛虱體內類酵母共生菌的營養(yǎng)功能及其分子基礎的研究[D];中國農業(yè)科學院;2005年

2 張學明;小鼠精原干細胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化及體外基因轉移[D];吉林大學;2005年

3 李碧春;生產轉基因雞基礎理論和方法的研究[D];西北農林科技大學;2000年

4 張風河;Ad-BMP2基因轉染肌衛(wèi)星細胞成骨誘導及骨缺損修復實驗研究[D];山東大學;2006年

5 張科偉;乳腺干細胞的體外培養(yǎng)、分離、鑒定及乳腺癌相關基因表達的研究[D];吉林大學;2008年

6 趙清梅;山羊角膜上皮細胞與角膜內皮細胞分離培養(yǎng)研究[D];西北農林科技大學;2008年

7 張建新;牛完全體外生產胚胎及胚胎性別鑒定取樣方法研究[D];山西農業(yè)大學;2005年

8 王曄玲;老齡兔骨髓間充質干細胞體外分離、培養(yǎng)及移植治療心肌梗死的研究[D];吉林大學;2007年

9 吳q;弓形蟲速殖子與緩殖子體外相互轉化模型的建立及可調性RNA干擾的初步研究[D];第一軍醫(yī)大學;2007年

10 陳曉;人骨髓間充質干細胞向造血細胞分化潛能的研究[D];吉林大學;2005年

相關碩士學位論文 前10條

1 高美麗;人胎兒角膜上皮細胞的體外培養(yǎng)和性質鑒定[D];青島大學;2009年

2 朱光榮;人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)及其細胞因子表達的研究[D];南京醫(yī)科大學;2003年

3 翁凡;牛體外受精的研究[D];新疆農業(yè)大學;2005年

4 顧春瑜;未成熟樹突狀細胞的體外培養(yǎng)及生物免疫學功能研究[D];第一軍醫(yī)大學;2005年

5 高光平;溫氏附紅細胞體體外培養(yǎng)、藥物篩選及疾病治療的試驗研究[D];青島農業(yè)大學;2007年

6 黃培信;人表皮干細胞定位、分離培養(yǎng)與端粒酶表達的實驗研究[D];南昌大學;2007年

7 姚桂東;一氧化氮對豬腔前卵泡生長發(fā)育影響的研究[D];安徽農業(yè)大學;2007年

8 秦麗娟;嗎啡對體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞LHR mRNA表達的影響[D];山西醫(yī)科大學;2007年

9 孫云霞;用序貫培養(yǎng)法對小鼠胚胎進行體外培養(yǎng)的觀察與研究[D];新疆醫(yī)科大學;2003年

10 丁月紅;IL-1β對體外培養(yǎng)小鼠早期胚胎發(fā)育的影響[D];昆明醫(yī)學院;2004年

本文編號：2606430