【摘要】： 近年來研究表明，各種原因?qū)е碌闹車窠?jīng)損傷，脊髓前角運動神經(jīng)元均出現(xiàn)不同程度的凋亡。周圍神經(jīng)損傷后引起相應(yīng)節(jié)段脊髓運動神經(jīng)元的死亡，嚴(yán)重影響了周圍神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)。因此，神經(jīng)損傷后，如何保護瀕臨死亡的神經(jīng)元，減少或阻止神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，已成為目前研究的熱點之一。 復(fù)制缺陷型重組腺病毒作為一種高效基因轉(zhuǎn)移載體，被廣泛用于將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞，它不僅能感染分裂期細(xì)胞，也可感染非分裂期細(xì)胞，因此被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)有效的基因轉(zhuǎn)染載體，為神經(jīng)系統(tǒng)基因治療帶來了希望。 Bcl-2(B-Lymphoma／Leukemia-2 gene)是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基本成員，被認(rèn)為能夠抑制凋亡發(fā)生的“抗凋亡基因”。近年來研究表明，Bcl-2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)保護性蛋白，提高Bcl-2的表達(dá)水平，不僅可保護神經(jīng)元對抗不同的損傷因素，而且能促使哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生。通過損傷局部轉(zhuǎn)染外源Bcl-2基因，是否能使位于中樞的脊髓運動神經(jīng)元Bcl-2的表達(dá)增加，是否可對抗周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致的脊髓運動神經(jīng)元凋亡，進而促使損傷的周圍神經(jīng)軸突再生和功能恢復(fù)?迄今為止，尚未見到相關(guān)報道。為此，本實驗利用基因同源重組原理構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad／s-Bcl-2、Ad／as-Bcl-2和Ad／LacZ，分別中介Bcl-2正義、反義cDNA和LacZ cDNA的轉(zhuǎn)染，通過腺病毒載體中介外源基因Bcl-2的轉(zhuǎn)染，從離體和活體兩個方面研究復(fù)制缺陷型重組腺病毒中介Bcl-2基因到脊髓運動神經(jīng)元來促進周圍神經(jīng)再生的可能性。本研究獲得以下主要結(jié)果： 1．成功地構(gòu)建了復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad／s-Bcl-2、Ad／as-Bcl-2和 AWhacZ。 2．Ad／s－Bcl2和Adias－Bcl工可感染原代培養(yǎng)的脊髓運動神經(jīng)元并改 變神經(jīng)元BC12的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染AdiS司 的神經(jīng)元無論是原位雜交還 一是免疫組化染色均較深，與其他三組比有顯著性差異；轉(zhuǎn)染 AdiAsE 的神經(jīng)元BC12的表達(dá)被封閉，BC12原位雜交和BC12免疫組化染色均較 淡，，與其他組比有顯著性差異；轉(zhuǎn)染A山LacZ組和對照組間無顯著性差異。 3．神經(jīng)元過表達(dá)BC12可顯著性對抗谷氨酸誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)脊髓運動 神經(jīng)元的凋亡，并顯著性地降低谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元內(nèi)ra》］i的增高。 Ad／s－BclZ組TUNEL陽性神經(jīng)元顯著性低于Adjas－Bcl－2組、Ad／LacZ組 。和谷氨酸組，神經(jīng)元內(nèi)［Cay］i也較后三者低，但較對照組高。Ad／as8＊2 組 TU’NEL陽性神經(jīng)元顯著性高于其它組，神經(jīng)元內(nèi)raz＋］i也較其它組高； AMiacZ組和谷氨酸組間無顯著性差異，但兩者均顯著性高于對照組。 4．神經(jīng)元過表達(dá)BC12可延長培養(yǎng)神經(jīng)元生存。培養(yǎng)的第7、9天時， Adis－BclZ組吞噬臺盼藍(lán)染料的陽性神經(jīng)元數(shù)較其它組少；AWhacZ和對 照組間無顯著性差異；第7天時Ad／。S－BC12組吞噬臺盼藍(lán)染料的神經(jīng)元數(shù) 較其它組多，第9天時，Adjas－BclZ組神經(jīng)元幾乎全部死亡。 5．在損傷周圍神經(jīng)處注射重組腺病毒載體，能在位于中樞的脊髓前 角運動神經(jīng)元中檢測到外源基因的表達(dá)。結(jié)果表明重組腺病毒能通過周圍 神經(jīng)進入中樞，神經(jīng)元染色7天時達(dá)高峰，以后逐漸降低，表達(dá)持續(xù)1月 左右。此結(jié)果也為脊髓基因治療提供潛在的治療方法，可避免在CNS不必 要的操作。 6．周圍神經(jīng)切斷損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元發(fā)生凋亡，表明神經(jīng)元的 凋亡可能為成年大鼠周圍神經(jīng)損傷引發(fā)神經(jīng)元死亡的主要病理過程。過表 達(dá)BCI．2可對抗周圍神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的脊髓運動神經(jīng)元的凋亡。AdiS－BC12 組大鼠脊髓TUNEL陽性神經(jīng)元較其它組少；Adi8S－BC12組TUNEL陽性 神經(jīng)元最多。注入Ad／LacZ和生理鹽水組，兩組脊髓TUNEL神經(jīng)元間無 顯著性差異。 7．BCI．2在脊髓運動神經(jīng)元中過表達(dá)可促進損傷神經(jīng)的再生和功能恢 Vll 復(fù)。過表達(dá)k．2可使脊髓運動神經(jīng)元GAP43表達(dá)增加，并加速AChE活 性和SFI恢復(fù)。 結(jié)論：重組腺病毒載體能介導(dǎo)BclZ基因在周圍神經(jīng)損傷局部轉(zhuǎn)染， 使位于脊髓的運動神經(jīng)元過表達(dá)BC12，提高神經(jīng)元凋亡的閾值，從而有效 地對抗周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致的脊髓運動神經(jīng)元的凋亡，進而促進神經(jīng)再生和 功能恢復(fù)，為周圍神經(jīng)再生的基因療法奠定理論和實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

一ZpA傭cl一2的構(gòu)建Figl一2eonstruetionofPAd/Bel一2

可用BamHI酶切鑒定Bcl一2cDNA插入方向的正反，正向插入時被BamHI酶切下一26obp的片段，命名為peDN刀sense一Bel一2;反向插入時被BamHI酶切下650bp片段，命名為pcDN刀antisense一Bel一2，如圖1一4所示。bPbP

本文編號：2605837