【摘要】：結(jié)核病是目前單因素引起發(fā)病率和死亡率最高的疾病。全球有三分之一的人群感染結(jié)核分枝桿菌，每年新增800萬(wàn)結(jié)核病人，有200萬(wàn)人死于結(jié)核病。世界衛(wèi)生組織于1993年宣布：全球處于結(jié)核病緊急狀態(tài)。引起結(jié)核病再次大流行的原因之一是不合理用藥導(dǎo)致的耐藥菌株的出現(xiàn)。為有效執(zhí)行DOTS(Directly ObservedTreatment, Short-Course)策略，快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和正確選擇抗生素治療成為防治結(jié)核病的關(guān)鍵。 利用串聯(lián)式壓電石英傳感器對(duì)環(huán)境電參數(shù)響應(yīng)靈敏的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于微生物生長(zhǎng)狀態(tài)監(jiān)測(cè)中，及早得到微生物的生長(zhǎng)信息。用串聯(lián)式壓電傳感器，分析培養(yǎng)基不同成分對(duì)微生物生長(zhǎng)壓電信號(hào)的影響；用單因素分析方法，分析不同成分對(duì)恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)曲線的影響。將M7H9培養(yǎng)基中成分的作用分為緩沖作用、合成代謝作用、生長(zhǎng)促進(jìn)因子作用，構(gòu)建分枝桿菌壓電檢測(cè)體系。對(duì)壓電頻移曲線進(jìn)行分類，將壓電頻移信號(hào)產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)分為分解代謝所分泌電導(dǎo)成分和合成代謝所吸收電導(dǎo)成分兩種類型，分別產(chǎn)生向下的頻移曲線和向上的頻移曲線，提升對(duì)串聯(lián)式壓電微生物傳感器頻移信號(hào)的理論認(rèn)識(shí)。 用噬菌體成斑率為指標(biāo)，研究噬菌體在環(huán)境中穩(wěn)定的條件，保證噬菌體的感染效率；研究噬菌體最佳的滅活方法，減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程出現(xiàn)假陽(yáng)性。分析鈣鎂濃度對(duì)噬菌體吸附、頓挫感染的影響，得出最佳的鈣離子濃度、殺毒劑硫酸亞鐵胺濃度。用一步生長(zhǎng)曲線研究噬菌體D29與恥垢分枝桿菌作用的特性，分析影響噬菌體生物放大作用的外部環(huán)境因素，優(yōu)化出最適合結(jié)核分枝桿菌快速檢測(cè)的培養(yǎng)基配方。綜合考慮噬菌體的穩(wěn)定條件、滅活條件、一步生長(zhǎng)曲線的最優(yōu)條件和恥垢分枝桿菌在M7H9培養(yǎng)基中壓電信號(hào)的影響因素，選擇適合構(gòu)建噬菌體生物放大的壓電傳感器檢測(cè)培養(yǎng)體系。 結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌能被噬菌體D29感染，保護(hù)菌體內(nèi)的噬菌體D29不被硫酸亞鐵殺滅。樣品中的結(jié)核分枝桿菌被作為載體，將加在樣品處理液中的噬菌體D29轉(zhuǎn)移到檢測(cè)池。在檢測(cè)池中，噬菌體D29裂解結(jié)核分枝桿菌釋放子代噬菌體，子代噬菌體感染恥垢分枝桿菌，經(jīng)歷快速的感染、復(fù)制、裂解的循環(huán)過(guò)程。這個(gè)循環(huán)過(guò)程構(gòu)成噬菌體鏈?zhǔn)缴锓糯蠓磻?yīng)，最終得到完全抑制恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)的結(jié)果。樣品中結(jié)核分枝桿菌的濃度不同，轉(zhuǎn)移到檢測(cè)池中的噬菌體D29的也濃度不同，完全抑制恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)所需的循環(huán)次數(shù)不同，最終導(dǎo)致檢測(cè)池中恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)程度不同。當(dāng)樣品中沒有結(jié)核分枝桿菌充當(dāng)噬菌體的載體時(shí)，則無(wú)噬菌體被轉(zhuǎn)移到檢測(cè)池中，恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)不受噬菌體抑制。恥垢分枝桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，利用培養(yǎng)基中的電導(dǎo)成分，引起壓電傳感器產(chǎn)生頻移響應(yīng)信號(hào)。不同濃度的結(jié)核分枝桿菌引起不同強(qiáng)度的壓電頻移響應(yīng)信號(hào)。 在液體培養(yǎng)基中，充分發(fā)揮噬菌體的鏈?zhǔn)椒糯笞饔�，提高檢測(cè)方法靈敏度。應(yīng)用壓電傳感器對(duì)電參數(shù)的靈敏響應(yīng)，提高檢測(cè)方法的靈敏度。通過(guò)噬菌體D29橋梁作用，將慢速生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)，轉(zhuǎn)換成快速生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌的檢測(cè)，大大提高檢測(cè)速度。噬菌體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的裂解作用，可降低實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，安全可靠。恥垢分枝桿菌檢測(cè)所需要培養(yǎng)基和儀器要求低，成本低廉。用數(shù)學(xué)模型分析檢出時(shí)間與溶液中噬菌體濃度的關(guān)系，得出檢測(cè)時(shí)間與溶液中1-102pfu/mL噬菌體D29濃度成線性的結(jié)果。用雙盲對(duì)照的原則研究樣本處理對(duì)檢測(cè)方法的影響，得出正確的樣本處理方法，保證結(jié)果的準(zhǔn)確度，避免假陽(yáng)性和假陰性。該方法可以檢測(cè)102cfu/mL的結(jié)核分枝桿菌，檢測(cè)時(shí)間縮短到30小時(shí)，具有臨床診斷實(shí)用價(jià)值。噬菌體放大多通道壓電傳感器法（PA-MSPQC）與Bactec MGIT960法的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較結(jié)果，得出兩者檢測(cè)臨床樣本的靈敏度和特異度一致。但PA-MSPQC法檢測(cè)時(shí)間只需30小時(shí)，優(yōu)于培養(yǎng)法。PA-MSPQC法還可以通過(guò)提高噬菌體感染效率，進(jìn)一步提高方法的靈敏度。 防止耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)是控制結(jié)核病的關(guān)鍵措施，實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌菌株耐藥的快速檢測(cè)，，對(duì)合理用藥和防止耐藥菌株的出現(xiàn)有非常重要的意義。我們根據(jù)噬菌體只能感染活的結(jié)核分枝桿菌的特點(diǎn)，將PA-MSPQC法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)。建立PA-MSPQC法耐藥結(jié)果的頻移標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和比例法耐藥的判別標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)利福平、異煙肼和乙胺丁醇三種藥物，當(dāng)恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)引起的頻移小于121Hz時(shí)，認(rèn)為菌株對(duì)藥物耐受；對(duì)鏈霉素藥物，當(dāng)恥垢分枝桿菌引起的壓電頻移小于92Hz時(shí)，判定菌株對(duì)鏈霉素耐藥。將雙盲實(shí)驗(yàn)中，PA-MSPQC法所得的結(jié)果與MGIT960法所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出PA-MSPQC法與MGIT960法沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，能準(zhǔn)確檢測(cè)臨床結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素等一線抗結(jié)核藥物的耐受情況。由于PA-MSPQC法能快速報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法用于臨床結(jié)核分枝桿菌菌株的耐藥實(shí)驗(yàn)。但是PA-MSPQC同樣存在噬菌體感染效率的問題，有可能將未感染噬菌體的結(jié)核分枝桿菌當(dāng)成耐藥菌株，影響方法的準(zhǔn)確度。因此，優(yōu)化培養(yǎng)基成分是提高檢測(cè)方法靈敏度，提高耐藥實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。 為建立微生物快速傳感檢測(cè)新方法，我們使用石墨烯新材料和核酸序列代替適配體進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)。用化學(xué)氣相沉積法在銅箔表面制備大面積石墨烯，用拉曼光譜分析在不同氣體條件下形成石墨烯的質(zhì)量，研究氫氣流量、溫度、基底材料對(duì)石墨烯質(zhì)量的影響，直接制備出可用于電極分析的大面積單層石墨烯。用電化學(xué)阻抗譜和循環(huán)伏安法研究核酸序列在石墨烯電表面吸附和解離的條件，得出鈉的濃度在100mmol/L、鎂的濃度在5mmol/L，核酸序列通過(guò)π-π堆集作用而吸附，電極表面電子傳遞阻力增大；在鈣、鎂離子的存在條件下，吸附的核酸序列與互補(bǔ)序列作用解離，電極表面電子傳遞阻力減�。浑姌O表面的電子傳遞阻力的擬合分析得出，電子傳遞阻力的改變與cDNA濃度成線性關(guān)系。適配體是與核酸序列同性質(zhì)的DNA序列，石墨烯電極和適配體為目標(biāo)分析物(如病原微生物)的快速傳感檢測(cè)提供可能。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.911

【共引文獻(xiàn)】

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8 高鶴;趙勇;劉承初;;致病微生物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫形成的VBNC狀態(tài)及其對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的潛在影響[J];微生物學(xué)通報(bào);2014年01期

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本文編號(hào)：2605777