【摘要】： era基因是1986年測定大腸桿菌基因組序列時，在編碼RNaseⅢ的rnc基 因下游發(fā)現(xiàn)的一個開放讀框，其編碼的蛋白具有鳥苷酸結合活性，氨基酸序列與 人和酵母的Ras有明顯相似性，故命名為E.coli Ras-like（era）基因。后來的研究表 明，era的同源序列存在于所有探討過的細菌中，era編碼的Era蛋白并不屬于 Ras家族，其獨特的C端使其成為一個新的G蛋白亞家族。 Era蛋白由兩個結構域組成，N端是一個典型的鳥苷酸結合蛋白結構域，與 其它G蛋白有較高的同源性；C端為Era家族所特有，，與其它蛋白家族無任何同 源性，其中含有一個RNA結合功能結構域—KH結構域。大腸桿菌era是屬于 rnc操縱元的一個細菌生存必需的基因，并參與細胞周期的調控，Era可以特異 地與16S-rRNA結合。陳蘇民教授在美國NIH工作期間，以大腸桿菌Era的C 端序列為靶序列，通過計算機搜索，發(fā)現(xiàn)從線蟲、小鼠到人都有與細菌Era同源 的EST序列，以此為線索，成功地克隆了人和小鼠全長的era-cDNA。在此基礎 上，本文對人Era的組織表達譜及其功能進行了相關研究。 在本研究工作中，首先對人era的表達分布規(guī)律進行探索。1、人era-mRNA 的組織分布規(guī)律：以人era編碼區(qū)基因為探針，用CLONTECH公司的MTN和MTE ＄四旱醫(yī)大學俗士攀位論文 第7 頁 雜交膜進行雜交，發(fā)現(xiàn)人。。－mRNA的大小為2．ZKb，分布于所有檢測的組織和 細胞系中，但表達水平有很大差異。表達最高的組織為心尖部、肝臟、胎肺和甲 狀腺。2、人。。。的蛋白表達分布規(guī)律：用課題組制備并經(jīng)過親和純化的兔抗人 Era多克隆抗體對幾種胎兒組織進行免疫組織化學染色，結果人Era蛋白分布于 絕大多數(shù)所檢測的組織，由強到弱依次為胰臟、肺、心臟、脾臟、胃、小腸、肝 臟和腎臟。 經(jīng)免疫電鏡檢測大腸桿菌Era定位于胞漿膜的內側面，其C端對細胞內定 位有著重要意義。為分析人ERA在細胞內的定位，構建了人Era與綠色熒光蛋白 融合的真核表達載體pSMEGFP－h(huán)Era和PEGFP－CI－h(huán)Era，即目的蛋白分別位于熒 光標簽蛋白（EGFP）的N端和C端。瞬時轉染NIH3T3細胞，帶熒光的融合蛋白 主要位于靠近核膜的胞漿部分；進一步用純化的兔抗人Era多克隆抗體對類風濕 關節(jié)炎滑膜細胞系RA，骨肉瘤細胞系MG63、胃癌細胞系7901等幾種培養(yǎng)細胞進 行問接免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)均有強弱不等的熒光，且主要分布于胞漿中。表明人 Era具有不同于大腸桿茵Era的細胞內定位，其細胞內分布以胞漿為主，可能具 有與細菌Era不同的信號轉導途徑。 為研究人Era對細胞形態(tài)、細胞周期的影響，進行以下工作：1、對人Era 的氨基酸序列進行了計算機分析，在此基礎上構建了人Era的定點突變體，其突 變的位置分別針對N端結構域的GTP結合位點和C端結構域的KH基序；2、 帶HA標簽的野生型和突變型人Era的真核表達載體，轉染Nll－I3T3細胞，篩選 到穩(wěn)定表達的細胞株。3、對穩(wěn)定表達人Era細胞株的細胞形態(tài)和細胞周期進行 分析，發(fā)現(xiàn)野生型人Era對細胞生長有促進作用，而KH基序突變后對細胞生長 起抑制作用。流式細胞儀分析表明，轉染野生型Era的細胞株表現(xiàn)為GZ期和S 期細胞增多，可能為DNA合成旺盛的結果；轉染Era S36N細胞株各時相細胞所 占百分數(shù)變化不明顯；轉染 Era 31 ON的細胞株 S期細胞和 GZ期細胞增多異常 顯著，結合細胞形態(tài)和生長曲線，可能存在細胞周期阻滯；即在細胞DNA復制后 期不能向M期轉化。 進一步使用完全可調控誘導表達系統(tǒng)表達突變型人Era，以深入研究該蛋白 的功能。在構建穩(wěn)定高表達蛻皮激素受體基因的細胞株3V3的基礎上，轉染突 變型人Era的表達載體進行壓力篩選，對所得到的單克隆細胞株進行誘導與未誘 DopGI’－’’’ent ofBtochthe andMolecularmp FMMU2001 竄回旱醫(yī)大學博士學位論文 章 呂 頁 導條件下細胞周期的分析，結果表明未誘導加酒精的對照細胞可以引起細胞凋 亡，而Era誘導表達后可以顯著抑制凋亡細胞的數(shù)量，Western表明Era S36N 可以誘導細胞仇 1－2表達，提示人 Era可能與細胞凋亡相關。 為進一步研究人Era的作用機理，對其結合蛋白的功能區(qū)進行鑒定，將人 。。a基因克隆入融合表達載體 PRSETB中，轉化大腸桿菌 BL21DE3（pLysS），經(jīng) IPTG誘導，表達6His－h(huán)Era融合蛋白。光密度掃描結果表明其占菌體總蛋白50％ 以上，表達產物分子量約為42KD，以包涵體形式存在。在SM i存在條件下，包 涵體溶解，利用6Hk與過渡態(tài)金屬離子N廣高親合力結合的性質，用N廣一叮A 親和樹脂一步法純化，即獲得純度達96％以上的6His－h(huán)Era融合蛋白。將純化的 蛋白進行包被，從噬菌體表面呈現(xiàn)隨機十＝肽庫中經(jīng)過三輪淘篩（Biopanning）， 并用ELISA檢測，篩選到具有人Era結合活性的陽性重組噬菌體克隆，測序后發(fā) 現(xiàn)大多（7／9）具有 HxHSxxH的氨基酸序列，初步認為是人 Era的結合基序，為 進一步Era結合蛋白基因的克隆及其功能研究提供了依據(jù)。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：Q784

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 黃勇;Era及其相互作用因子功能研究[D];第四軍醫(yī)大學;2007年

本文編號：2602741