【摘要】：【目的】 帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，線粒體氧化應激和神經(jīng)元凋亡在PD的病理機制中發(fā)揮關鍵的作用。雷帕霉素(rapamycin)為雷帕霉素靶蛋白(Target of rapamycin, TOR)信號通路特異性抑制劑，在一系列神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的病理機制及治療中具有重要的意義。本研究通過雷帕霉素預處理PD大鼠及細胞模型，揭示其在PD中的神經(jīng)保護作用，并探討其機制。 【方法】 動物實驗：實驗SD大鼠隨機分為假手術組、PD模型組、雷帕霉素低劑量組(0.05mg/kg/d)、中劑量組(0.5mg/kg/d)及高劑量組(5mg/kg/d)進行雷帕霉素灌胃預處理。7天后，向模型組和所有雷帕霉素預處理組大鼠腦部右側紋狀體兩點定向注射6-羥基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)(4μg/μl,2μl/注射點)誘導建立PD大鼠模型，假手術組大鼠注射生理鹽水作為對照。術后第25天各組大鼠均用阿撲嗎啡(0.5mg/kg)誘導旋轉試驗，檢測行為學指標；在造模后第28天，各組大鼠經(jīng)心臟灌注固定，取腦組織進行黑質-紋狀體酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）免疫組化染色及透射電子顯微鏡觀察；檢測各組SD大鼠中腦丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)活性；提取腦組織總RNA后，采用RT-PCR方法檢測黑質-紋狀體內Bax、Bcl-2和p47phox等基因mRNA的表達；同時采用western blot方法檢測黑質-紋狀體內Bax、Bcl-2、細胞色素c以及cleavedcaspase-9蛋白質的表達。 體外實驗：采用不同濃度6-OHDA誘導24h后檢測PC12細胞存活率，建立PD細胞模型。不同濃度雷帕霉素預處理PC12細胞3h、6h、12h和24h，100μM濃度6-OHDA誘導24h后，使用CCK-8細胞計數(shù)試劑盒檢測PC12細胞不同時間點的存活率。采用3μM濃度雷帕霉素預處理6h，100μM濃度6-OHDA誘導24h后，使用丙啶碘化物(Propidium iodide, PI)單染試劑盒檢測雷帕霉素對損傷PC12細胞周期的影響。同時使用AnnexinⅤ-FITC和PI雙染試劑盒，通過流式細胞儀檢測各處理組PC12細胞凋亡的變化。雷帕霉素預處理6h，6-OHDA誘導1h后，使用含DCFH-DA熒光探針的試劑盒檢測各處理組PC12細胞中活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)的生成。收集各組PC12細胞，提取細胞總RNA，通過real-time RT-PCR檢測各處理組PC12細胞內P47phox、TH、血紅素加氧酶-1(hemo oxygenase-1, HO-1)和轉錄因子NF-E2相關因子2(transcriptional factor NF-E2-related factor2，Nrf2)的mRNA表達。 【結果】 一、動物實驗結果：(1)與模型組相比，各劑量雷帕霉素預處理組大鼠的旋轉行為減輕(p0.05)。(2)與假手術組相比，PD模型組損傷側黑質部位中TH+細胞數(shù)量明顯減少(p0.001)；與模型組比較，各雷帕霉素預處理組大鼠損傷側TH+細胞數(shù)量則明顯增加(p0.001)。(3)模型組黑質-紋狀體細胞器結構不清，細胞核皺縮，染色質異常聚集；線粒體體積增大，呈空泡樣變，線粒體嵴溶解。而不同劑量的雷帕霉素預處理則明顯減輕細胞超微結構的異常。(4)與假手術組比較，PD模型組MDA含量明顯升高(p0.001)，而SOD和GSH-PX的活性明顯降低(p0.001)。與PD模型組比較，經(jīng)雷帕霉素預處理后，各劑量組MDA的含量均顯著降低(p0.01)，而SOD和GSH-PX的活性較PD模型組升高(p0.05)。(5)與假手術組相比，PD模型組Bcl-2mRNA水平(p=0.001)明顯降低而Bax mRNA水平(p0.001)明顯升高。與PD模型組比較，雷帕霉素預處理升高Bcl-2mRNA水平(p0.01)，同時降低BaxmRNA的表達(p0.05)，同時Bcl-2和Bax蛋白的表達與RT-PCR的檢測結果相似。(6)與假手術組比較，PD模型組P47phoxmRNA的表達明顯升高(p0.001)，而雷帕霉素預處理顯著下調PD大鼠模型中P47phoxmRNA的表達(p0.01)。在PD模型組中活性caspase-9的表達和細胞色素c的釋放比假手術組均明顯升高(p0.001)。與PD模型組比較，，不同劑量雷帕霉素預處理均可降低PD大鼠活性caspase-9的表達和細胞色素c的釋放(p0.05)。然而，在雷帕霉素三個劑量組之間，所有研究結果包括旋轉行為、TH+細胞數(shù)量、氧化應激指標及Bcl-2、Bax、P47phox、細胞色素c和caspase-9的表達均無顯著統(tǒng)計學差異。 二、細胞實驗結果：(1)100μM濃度的6-OHDA處理24小時后，PC12細胞接近半數(shù)死亡，其存活率為57.67±9.84%。(2)0.5μM-15μM濃度的雷帕霉素單獨作用24h，PC12細胞存活率與空白對照組相比均無統(tǒng)計學差異(p0.05)，而雷帕霉素單獨作用48h和72h則出現(xiàn)抑制PC12細胞存活率的現(xiàn)象。(3)與6-OHDA組相比，當0.5μM-3μM濃度的雷帕霉素預處理PC12細胞3h-12h，明顯升高損傷細胞的存活率(p0.05)。其中，3μM雷帕霉素預處理6h對損傷PC12細胞存活率的改善作用最顯著(p0.01)。(4)與空白對照組相比，6-OHDA使PC12細胞中處于G0/G1期的細胞明顯增多(p0.001)，S期(p=0.001)和G2/M期(p=0.009)細胞則明顯減少。而3μM雷帕霉素的預處理后6h后，G0/G1期細胞與6-OHDA組比較顯著減少(p=0.018)，S期細胞明顯增多(p=0.028)，但G2/M期細胞數(shù)量無統(tǒng)計學差異。(5)單加雷帕霉素對PC12細胞的凋亡無明顯影響，6-OHDA處理后細胞凋亡較正常細胞明顯增多(p0.001)，而3μM雷帕霉素預處理6h，則明顯減少6-OHDA所誘導的細胞凋亡(p0.05)。(6)單加雷帕霉素對PC12細胞內ROS的水平無明顯影響，6-OHDA的誘導使PC12細胞內ROS含量明顯增多(p0.01)，而雷帕霉素預處理則抑制損傷細胞中ROS的生成(p0.05)。(7)單用3μM雷帕霉素處理正常PC12細胞6h-12h，HO-1和Nrf2mRNA的表達明顯升高(p0.05)，而在處理24h-48h兩者的表達又回落至接近0h水平；(8)與正常PC12細胞比較，6-OHDA顯著升高PC12細胞中P47phox而降低TH mRNA的表達(p0.05)；與6-OHDA組相比，3μM雷帕霉素預處理6h后，P47phoxmRNA的表達下降而TH mRNA的表達明顯升高(p0.05)。與正常對照組比較，6-OHDA可升高PC12細胞中HO-1和Nrf2mRNA的表達(p0.05)，與6-OHDA組相比，3μM雷帕霉素預處理6h后，則進一步上調HO-1和Nrf2mRNA的表達(p0.05)。 【結論】 雷帕霉素可有效改善PD大鼠模型的行為學癥狀、降低黑質多巴胺能神經(jīng)元的丟失和促凋亡分子的表達。在PD細胞模型中證實，雷帕霉素具有提高損傷細胞的生存能力和減少細胞凋亡的生物學作用。細胞周期的改變和抗氧化應激能力的增強可能是其神經(jīng)保護作用的重要機制。由此，恢復氧化應激中調控信號的平衡可能為PD的藥物治療拓展新的途徑。
【圖文】：

圖 1 雷帕霉素分子結構示意圖OR 信號通路與線粒體功能、氧化應激和凋亡號通路的活性、TOR-raptor復合體的形成與ATP生成和線粒TOR-raptor復合體引起線粒體功能的改變[24]。TOR對線粒體組織的差異。在骨骼肌組織，雷帕霉素依賴過氧化物酶體子1α (peroxisome-proliferatoractivated receptor coactivator，(oxidative phosphorylation，OXPHOS)元件的基因表達，從]；在白血病細胞中，抑制TOR同樣降低線粒體膜電位，降的生成[24]；而在肌細胞中，TORC1的活化可以增強線粒體小鼠脂肪組織特異性的敲除Raptor蛋白后，線粒體耗氧量升脂飲食而避免體重增加[27]，這可能是由于核及線粒體基因白表達全面上調所致[28]。在腦組織中，TOR信號通路與線

圖 1-1 PD 模型大鼠的旋轉行為表 1-2 各組大鼠的旋轉行為檢測組別 旋轉圈數(shù)(圈/30min)S 組 0±0.0P 組 406.7±67.7L-R 組 336.6±58.0*M-R 組 348.8±55.8*H-R 組 317.1±52.6*S 組：假手術對照組；P 組：PD 模型組；L-R 組：低劑量雷帕霉素預處理組；M-R 組劑量雷帕霉素預處理組；H-R 組：高劑量雷帕霉素預處理組。與 P 組比較，* p＜0.05。(n=2 雷帕霉素對 PD 大鼠模型中多巴胺能神經(jīng)元的保護作用
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R742.5

【共引文獻】

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本文編號：2602993