【摘要】：【目的】 帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，線粒體氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡在PD的病理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。雷帕霉素(rapamycin)為雷帕霉素靶蛋白(Target of rapamycin, TOR)信號(hào)通路特異性抑制劑，在一系列神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的病理機(jī)制及治療中具有重要的意義。本研究通過(guò)雷帕霉素預(yù)處理PD大鼠及細(xì)胞模型，揭示其在PD中的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。 【方法】 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、PD模型組、雷帕霉素低劑量組(0.05mg/kg/d)、中劑量組(0.5mg/kg/d)及高劑量組(5mg/kg/d)進(jìn)行雷帕霉素灌胃預(yù)處理。7天后，向模型組和所有雷帕霉素預(yù)處理組大鼠腦部右側(cè)紋狀體兩點(diǎn)定向注射6-羥基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)(4μg/μl,2μl/注射點(diǎn))誘導(dǎo)建立PD大鼠模型，假手術(shù)組大鼠注射生理鹽水作為對(duì)照。術(shù)后第25天各組大鼠均用阿撲嗎啡(0.5mg/kg)誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，檢測(cè)行為學(xué)指標(biāo)；在造模后第28天，各組大鼠經(jīng)心臟灌注固定，取腦組織進(jìn)行黑質(zhì)-紋狀體酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）免疫組化染色及透射電子顯微鏡觀察；檢測(cè)各組SD大鼠中腦丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)活性；提取腦組織總RNA后，采用RT-PCR方法檢測(cè)黑質(zhì)-紋狀體內(nèi)Bax、Bcl-2和p47phox等基因mRNA的表達(dá)；同時(shí)采用western blot方法檢測(cè)黑質(zhì)-紋狀體內(nèi)Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素c以及cleavedcaspase-9蛋白質(zhì)的表達(dá)。 體外實(shí)驗(yàn)：采用不同濃度6-OHDA誘導(dǎo)24h后檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率，建立PD細(xì)胞模型。不同濃度雷帕霉素預(yù)處理PC12細(xì)胞3h、6h、12h和24h，100μM濃度6-OHDA誘導(dǎo)24h后，使用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢測(cè)PC12細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的存活率。采用3μM濃度雷帕霉素預(yù)處理6h，100μM濃度6-OHDA誘導(dǎo)24h后，使用丙啶碘化物(Propidium iodide, PI)單染試劑盒檢測(cè)雷帕霉素對(duì)損傷PC12細(xì)胞周期的影響。同時(shí)使用AnnexinⅤ-FITC和PI雙染試劑盒，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各處理組PC12細(xì)胞凋亡的變化。雷帕霉素預(yù)處理6h，6-OHDA誘導(dǎo)1h后，使用含DCFH-DA熒光探針的試劑盒檢測(cè)各處理組PC12細(xì)胞中活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)的生成。收集各組PC12細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)real-time RT-PCR檢測(cè)各處理組PC12細(xì)胞內(nèi)P47phox、TH、血紅素加氧酶-1(hemo oxygenase-1, HO-1)和轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(transcriptional factor NF-E2-related factor2，Nrf2)的mRNA表達(dá)。 【結(jié)果】 一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)與模型組相比，各劑量雷帕霉素預(yù)處理組大鼠的旋轉(zhuǎn)行為減輕(p0.05)。(2)與假手術(shù)組相比，PD模型組損傷側(cè)黑質(zhì)部位中TH+細(xì)胞數(shù)量明顯減少(p0.001)；與模型組比較，各雷帕霉素預(yù)處理組大鼠損傷側(cè)TH+細(xì)胞數(shù)量則明顯增加(p0.001)。(3)模型組黑質(zhì)-紋狀體細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)異常聚集；線粒體體積增大，呈空泡樣變，線粒體嵴溶解。而不同劑量的雷帕霉素預(yù)處理則明顯減輕細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的異常。(4)與假手術(shù)組比較，PD模型組MDA含量明顯升高(p0.001)，而SOD和GSH-PX的活性明顯降低(p0.001)。與PD模型組比較，經(jīng)雷帕霉素預(yù)處理后，各劑量組MDA的含量均顯著降低(p0.01)，而SOD和GSH-PX的活性較PD模型組升高(p0.05)。(5)與假手術(shù)組相比，PD模型組Bcl-2mRNA水平(p=0.001)明顯降低而B(niǎo)ax mRNA水平(p0.001)明顯升高。與PD模型組比較，雷帕霉素預(yù)處理升高Bcl-2mRNA水平(p0.01)，同時(shí)降低BaxmRNA的表達(dá)(p0.05)，同時(shí)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相似。(6)與假手術(shù)組比較，PD模型組P47phoxmRNA的表達(dá)明顯升高(p0.001)，而雷帕霉素預(yù)處理顯著下調(diào)PD大鼠模型中P47phoxmRNA的表達(dá)(p0.01)。在PD模型組中活性caspase-9的表達(dá)和細(xì)胞色素c的釋放比假手術(shù)組均明顯升高(p0.001)。與PD模型組比較，，不同劑量雷帕霉素預(yù)處理均可降低PD大鼠活性caspase-9的表達(dá)和細(xì)胞色素c的釋放(p0.05)。然而，在雷帕霉素三個(gè)劑量組之間，所有研究結(jié)果包括旋轉(zhuǎn)行為、TH+細(xì)胞數(shù)量、氧化應(yīng)激指標(biāo)及Bcl-2、Bax、P47phox、細(xì)胞色素c和caspase-9的表達(dá)均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)100μM濃度的6-OHDA處理24小時(shí)后，PC12細(xì)胞接近半數(shù)死亡，其存活率為57.67±9.84%。(2)0.5μM-15μM濃度的雷帕霉素單獨(dú)作用24h，PC12細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)，而雷帕霉素單獨(dú)作用48h和72h則出現(xiàn)抑制PC12細(xì)胞存活率的現(xiàn)象。(3)與6-OHDA組相比，當(dāng)0.5μM-3μM濃度的雷帕霉素預(yù)處理PC12細(xì)胞3h-12h，明顯升高損傷細(xì)胞的存活率(p0.05)。其中，3μM雷帕霉素預(yù)處理6h對(duì)損傷PC12細(xì)胞存活率的改善作用最顯著(p0.01)。(4)與空白對(duì)照組相比，6-OHDA使PC12細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞明顯增多(p0.001)，S期(p=0.001)和G2/M期(p=0.009)細(xì)胞則明顯減少。而3μM雷帕霉素的預(yù)處理后6h后，G0/G1期細(xì)胞與6-OHDA組比較顯著減少(p=0.018)，S期細(xì)胞明顯增多(p=0.028)，但G2/M期細(xì)胞數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(5)單加雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響，6-OHDA處理后細(xì)胞凋亡較正常細(xì)胞明顯增多(p0.001)，而3μM雷帕霉素預(yù)處理6h，則明顯減少6-OHDA所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(p0.05)。(6)單加雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的水平無(wú)明顯影響，6-OHDA的誘導(dǎo)使PC12細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯增多(p0.01)，而雷帕霉素預(yù)處理則抑制損傷細(xì)胞中ROS的生成(p0.05)。(7)單用3μM雷帕霉素處理正常PC12細(xì)胞6h-12h，HO-1和Nrf2mRNA的表達(dá)明顯升高(p0.05)，而在處理24h-48h兩者的表達(dá)又回落至接近0h水平；(8)與正常PC12細(xì)胞比較，6-OHDA顯著升高PC12細(xì)胞中P47phox而降低TH mRNA的表達(dá)(p0.05)；與6-OHDA組相比，3μM雷帕霉素預(yù)處理6h后，P47phoxmRNA的表達(dá)下降而TH mRNA的表達(dá)明顯升高(p0.05)。與正常對(duì)照組比較，6-OHDA可升高PC12細(xì)胞中HO-1和Nrf2mRNA的表達(dá)(p0.05)，與6-OHDA組相比，3μM雷帕霉素預(yù)處理6h后，則進(jìn)一步上調(diào)HO-1和Nrf2mRNA的表達(dá)(p0.05)。 【結(jié)論】 雷帕霉素可有效改善PD大鼠模型的行為學(xué)癥狀、降低黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失和促凋亡分子的表達(dá)。在PD細(xì)胞模型中證實(shí)，雷帕霉素具有提高損傷細(xì)胞的生存能力和減少細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用。細(xì)胞周期的改變和抗氧化應(yīng)激能力的增強(qiáng)可能是其神經(jīng)保護(hù)作用的重要機(jī)制。由此，恢復(fù)氧化應(yīng)激中調(diào)控信號(hào)的平衡可能為PD的藥物治療拓展新的途徑。
【圖文】：

圖 1 雷帕霉素分子結(jié)構(gòu)示意圖OR 信號(hào)通路與線粒體功能、氧化應(yīng)激和凋亡號(hào)通路的活性、TOR-raptor復(fù)合體的形成與ATP生成和線粒TOR-raptor復(fù)合體引起線粒體功能的改變[24]。TOR對(duì)線粒體組織的差異。在骨骼肌組織，雷帕霉素依賴過(guò)氧化物酶體子1α (peroxisome-proliferatoractivated receptor coactivator，(oxidative phosphorylation，OXPHOS)元件的基因表達(dá)，從]；在白血病細(xì)胞中，抑制TOR同樣降低線粒體膜電位，降的生成[24]；而在肌細(xì)胞中，TORC1的活化可以增強(qiáng)線粒體小鼠脂肪組織特異性的敲除Raptor蛋白后，線粒體耗氧量升脂飲食而避免體重增加[27]，這可能是由于核及線粒體基因白表達(dá)全面上調(diào)所致[28]。在腦組織中，TOR信號(hào)通路與線

圖 1-1 PD 模型大鼠的旋轉(zhuǎn)行為表 1-2 各組大鼠的旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè)組別 旋轉(zhuǎn)圈數(shù)(圈/30min)S 組 0±0.0P 組 406.7±67.7L-R 組 336.6±58.0*M-R 組 348.8±55.8*H-R 組 317.1±52.6*S 組：假手術(shù)對(duì)照組；P 組：PD 模型組；L-R 組：低劑量雷帕霉素預(yù)處理組；M-R 組劑量雷帕霉素預(yù)處理組；H-R 組：高劑量雷帕霉素預(yù)處理組。與 P 組比較，* p＜0.05。(n=2 雷帕霉素對(duì) PD 大鼠模型中多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R-332;R742.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2602993