【摘要】： 慢性HBV感染的抗病毒治療一直是醫(yī)學(xué)界的重大難題，現(xiàn)有干擾素和拉米夫定的臨床療效有限，不斷嘗試進(jìn)行的其它治療方法，至今又尚無(wú)令人滿意的結(jié)果，RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn)，為處于困境中的研究又帶來(lái)一線新的希望。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)以序列特異性的方式引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后同源性RNA降解的現(xiàn)象，也稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)，是生物體針對(duì)外來(lái)轉(zhuǎn)座子和病毒感染進(jìn)化形成的一種古老而保守的防御機(jī)制。在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，短至21-～23-nt的雙鏈RNA可以作為小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)分子在宿主細(xì)胞內(nèi)快速、高效、特異地引發(fā)外源或內(nèi)源性靶mRNA的降解，進(jìn)而抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，卻不引起非特異性干擾素應(yīng)答。這一重大發(fā)現(xiàn)使得RNA干擾技術(shù)迅速發(fā)展成為當(dāng)今抗病毒、抗腫瘤和蛋白功能分析的有利工具。然而siRNA的有效性高度依賴其靶RNA的特殊位點(diǎn)，盡管在設(shè)計(jì)siRNA位點(diǎn)時(shí)已有一些可供遵循的原則，但這些候選的siRNA最終仍然需要通過(guò)大量耗時(shí)費(fèi)力的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證和篩選，因此建立高效、經(jīng)濟(jì)快速篩選獲取有效siRNA的方法對(duì)RNAi技術(shù)的開(kāi)展應(yīng)用具有重要的實(shí)際意義。 良好的篩選體系首先取決于快速、經(jīng)濟(jì)地獲取siRNA的方法。化學(xué)合成siRNA成本太高，體外轉(zhuǎn)錄生物合成的方法在RNA操作上較困難，而載體表達(dá)方法在載體構(gòu)建時(shí)又較繁瑣耗時(shí)。相比而言，直接采用PCR制備siRNA或shRNA表達(dá)框(siRNA expression cassettes， 浙江人學(xué)!刃卜學(xué)位價(jià)氣沁 SEC)的方法則以其經(jīng)濟(jì)、快捷的優(yōu)勢(shì)而成為篩選siRNA及其最適搭配啟動(dòng)子非常有效的__l: 具。通常SEC包含一個(gè)RNA聚合酶啟動(dòng)子、一段shRNA編碼片斷和一個(gè)RNA聚合酶終!卜 序列。為避開(kāi)含有二級(jí)結(jié)構(gòu)shONA擴(kuò)增困難的問(wèn)題，一般采川兩步PCR反應(yīng)，但是這種方 法可能會(huì)因兩次PCR反應(yīng)而增加堿基錯(cuò)摻率，從而影響.高度序列特異的RNAi效應(yīng)。因此， 在本研究第一部分著重探索建立簡(jiǎn)單高效的重疊延伸一步PCR方法，以能夠保質(zhì)保星地構(gòu)建 和擴(kuò)增sEC，少t以增強(qiáng)刑綠色熒光蛋自(enllaneed green fluoreseence protein，EoFp)作為靶 基因，證實(shí)PCR制備的SEC用于瞬時(shí)RNAi效應(yīng)研究及有效siRNA篩選的可行性。 人規(guī)模siRNA篩選_「作還取決于簡(jiǎn)便易行、快速準(zhǔn)確的效應(yīng)報(bào)告系統(tǒng)。目前應(yīng)用最為，’‘ 泛的是熒光蛋白，它通過(guò)易T-檢測(cè)的熒光表達(dá)來(lái)反映與之融合的目標(biāo)基因表達(dá)情況。以此建 立的致病基因表達(dá)報(bào)告系統(tǒng)，使包括siRNA在內(nèi)各種墓因治療方法的效果評(píng)估變得方便而高 效。在本研究第二部分，我們即以增強(qiáng)型綠色熒光蛋rl(enhaneed green fluoreseent protein， EGFP)作為報(bào)告分子建立HBx瞬時(shí)表達(dá)的快速報(bào)告系統(tǒng)，Jt運(yùn)川第一部分介紹的重疊延伸一 步PcR法制備針對(duì)細(xì)胞外源致病基因l一IBx的ShRNA表達(dá)框，初步建立了HBx一siRNA快速篩 選體系，將從該體系篩選到的最佳SEC再用J飛穩(wěn)定表達(dá)Fll3v的2.2.15細(xì)胞，做進(jìn)一步驗(yàn)證 及抗HBV的效果評(píng)價(jià)。 機(jī)體內(nèi)病毒感染的建立取決于病毒和宿土兩方面因素，病毒在其各個(gè)生活周期中都需要 諸多細(xì)胞蛋自功能的輔助和參與。近年研究發(fā)現(xiàn)La蛋自是HBV RNA的一個(gè)重要穩(wěn)定因子， 即結(jié)構(gòu)功能完披的小鼠La蛋白能夠與HBv RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列(HBv pesttranscriPtional regulato叮ele，nent，，HpRE)結(jié)合，保護(hù)存在T. 1 IBv RNAJ二(tJ核酸內(nèi)tjJ醉切冉IJ位點(diǎn).使之免遭 核內(nèi)核酸酶的降解，從而在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮穩(wěn)定}IBV RNA的玉妥作用。最近有研究報(bào)道體外表 達(dá)人La蛋自(human La protein，hLa)也可以與日PRE高親不11力、特異性結(jié)合，提示人La蛋 自也可以與也HBV RNA相互作用，但是否直接參與11日v RNA代謝尚不消楚.本研究第二部 分即乍{對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性基因La蛋自，繼續(xù)采川SEC介導(dǎo)RNAi的方法，以穩(wěn)定產(chǎn)生HBV的2.2.15 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯咳薒a蛋自功能與HBV基因表達(dá)變化的關(guān)系，進(jìn)而探討人La蛋自在 HBV RNA代謝表達(dá)過(guò)程中可能的作用，以及將人La蛋自視為宿上共因子川T-抗日BV治療靶 標(biāo)的可行性。 浙江人學(xué)協(xié)卜學(xué)位論文 第一部分:shRNA表達(dá)框快速制備方法的建立 方法和結(jié)果: 1.重疊延伸一步PcR制備u6+l、Hl、tRNAval三種啟動(dòng)子一sllRNA表達(dá)框首先通過(guò)PcR 方法制備含有兩端相同添加接頭的二種RNA多聚酶川(RNA polymerase 111，RNA po，川) 啟動(dòng)子(u6+I、Hl和tRNAVal) PcR引物通川型模板，再設(shè)計(jì)合成末端延長(zhǎng)的3’端長(zhǎng)片 段基因特異性延伸引物(包含shRNA編碼序列和RNA pol川轉(zhuǎn)錄終lr.序列)、及上游和 下游通用引物。用上述模板和引物經(jīng)重疊延伸一步1’、.、又應(yīng)即可一次性快速、簡(jiǎn)捷地獲 得結(jié)構(gòu)完整、產(chǎn)物條帶單一的三種RNA pol 111一sEC。 2.驗(yàn)證SEC介導(dǎo)的RNAi效應(yīng)及SEC策略篩選有效siRNA的可行性將針對(duì)EGFP兩處 siRNA位點(diǎn)的SEC與表達(dá)質(zhì)粒pEGFP一NI共轉(zhuǎn)染日叩GZ細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì) 胞儀和半定量R不PCR檢測(cè)分析SEC對(duì)EGFP蛋自和mRNA表達(dá)的抑制效果。結(jié)果證實(shí) T文獻(xiàn)報(bào)道的siEoFp244有效性，t朋^val不一
【圖文】：

圖I-I):為含有U6snR1Va多

PAYUGa27質(zhì)牡田
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王淑霞;閆志勇;王力秋;趙海燕;劉成玉;王斌;;原發(fā)性肝細(xì)胞癌病人PBMCs中HBV X、P基因的整合[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年03期

2 王力;朱明華;李詠梅;李芳梅;;抑制性消減雜交構(gòu)建乙型肝炎病毒X蛋白羧基端缺失40個(gè)氨基酸cDNA文庫(kù)[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2006年10期

3 張婷;趙迎澤;羅進(jìn)勇;盧曉娟;文巍;馮濤;;HBX基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及在LO_2細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年07期

4 王霞;楊林;佘吉佳;范紅梅;張富程;陳幼明;謝奇峰;;乙型肝炎病毒X蛋白對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡及p53、PTEN表達(dá)的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年08期

5 陳紅英 ,王小眾;HBV X基因與肝細(xì)胞凋亡[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年03期

6 谷文靜;張新毅;付曉燕;;肝細(xì)胞癌形成的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年01期

7 唐耘天;李辛平;劉天奇;楊建榮;羅建強(qiáng);梁中驍;;原發(fā)性肝癌人群中核因子κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因的多態(tài)性[J];廣東醫(yī)學(xué);2012年08期

8 ;Effects of cell cycle on telomerase activity and on hepatitis B virus replication in HepG_22.2.15 cells[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2004年04期

9 ;Hepatitis B virus X protein promotes proliferation and upregulates TGF-β1 and CTGF in human hepatic stellate cell line,LX-2[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2009年01期

10 范紅梅;楊林;;乙型肝炎病毒X蛋白的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J];國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志;2006年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王琦;乙型肝炎病毒X蛋白突變體致癌作用及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究[D];南開(kāi)大學(xué);2010年

2 吳勝昔;乙型肝炎病毒X蛋白上調(diào)共抑制分子B7-H1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

3 王兆卿;中心體定位的具有原癌基因?qū)傩缘娜嗽葱禄騝epo的功能研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

4 劉曉紅;乙型肝炎病毒X蛋白羧基端缺失突變體對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

5 張秋;TRAIL及其相關(guān)分子在HBV感染所致凋亡改變中的機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2005年

6 張建林;乙肝病毒X蛋白相關(guān)細(xì)胞因子的分離、鑒定及功能性研究[D];武漢大學(xué);2004年

7 焦楊;Wnt通路相關(guān)基因在AFB1誘導(dǎo)大鼠肝癌及人肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2006年

8 張士猛;HBx相互作用蛋白及HBV受體研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

9 朱榮;慢性乙型肝炎組織病理學(xué)指標(biāo)及病毒X基因變異與患者預(yù)后的相關(guān)性研究[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

10 張旭照;胞嘧啶脫氨酶APOBEC3s在肝細(xì)胞肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用[D];浙江大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 郭晨;表達(dá)HBVX基因小鼠模型的建立及其對(duì)肝細(xì)胞凋亡因子的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

2 尹曉玲;乙型肝炎病毒X蛋白對(duì)小鼠足細(xì)胞補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59和Crry表達(dá)的影響[D];華中科技大學(xué);2010年

3 董為;Wnt/β-catenin信號(hào)通路在HBx基因體外誘導(dǎo)大鼠卵圓細(xì)胞惡化過(guò)程中的作用[D];華中科技大學(xué);2010年

4 馬婧薇;ASGPR介導(dǎo)的靶向siRNA抑制HBV的復(fù)制與表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2009年

5 彭亮;不同結(jié)構(gòu)形式的HBx蛋白對(duì)其在肝癌細(xì)胞HepG2中分布的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

6 閃明海;HBVC1653T位點(diǎn)突變、A1762T/G1764A雙位點(diǎn)突變與肝細(xì)胞癌關(guān)系的研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2011年

7 孫麗芳;HBx轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞因子的表達(dá)及GST-MIG，GST-IP-10融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2011年

8 畢利泉;Wnt5a基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2011年

9 王淑霞;HCC患者PBMCs中HBV逆轉(zhuǎn)錄酶P基因的表達(dá)與X、P基因整合的研究[D];青島大學(xué);2004年

10 陳紅英;HBV X基因的轉(zhuǎn)染及表達(dá)對(duì)HL-7702肝細(xì)胞凋亡的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2004年

本文編號(hào)：2602515